[发明专利]环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明涉及环介导切刻等温‑CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂盒及方法。本发明对裂谷热病毒S基因中一个片段的设计了5条引物，并利用链置换Bst DNA聚合酶以及特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，实现核酸指数扩增；利用切刻酶切刻活性和Bst DNA聚合酶链置换活性生成大量单链片段。再利用Cas12a蛋白和向导RNA形成的二元复合体的模板依赖顺式切割活性介导的反式切割活性进行检测，快速、高效和准确；该技术对裂谷热病毒的检测灵敏度高、操作简便，成本低，可以和胶体金试纸偶联实现快速实时检测，可以很好补充裂谷热病毒快速检测的方案。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其是涉及环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

裂谷热(Rift valley fever，RVF)是由裂谷热病毒(Rift valley fever virus，RVFV)引起的急性出血性人兽共患病，属于布尼亚病毒目白纤病毒科白蛉病毒属，经蚊虫传播，可感染动物和人。人感染后通常无症状或者症状较轻少数发展为急性肝炎、出血热或者脑炎综合症。其基因组为单股负链RNA病毒，基因组可分为L(大)、M(中)、S(小)三个节段。裂谷热在我国被列为一类传染病，对我国的公共卫生安全有现实性的威胁，建立一种快速准确检测裂谷热病毒的方法显得尤为重要。

环介导等温扩增是日本科学家在2000年左右发明的技术，通过识别模板序列200bp左右的序列中的4-6段位置实现，链置换酶发挥链置换作用来形成环介导等温扩增核心元件，形成指数扩增。环介导等温扩增技术，引物设计简单，操作方便，对机器要求低，甚至可以在水浴锅进行反应，非常适合实时检测。结果判断方法很多，可以为荧光、可视化染料以及浊度变化，非常适合临床实时检测的要求，可以在1h内直接出诊断报告，极大压缩诊断消耗的时间。

切刻酶是一类核酸内切酶可以识别特异性的切刻位点，其能在识别位点链上形成切刻位点，形成单链缺口。通过DNA聚合酶的链置换能力和切刻酶的特性可以实现链置换反应，生成大量重复的单链片段。通过在环介导等温扩增产物茎环上引入切刻酶识别位点，可以在实现指数扩增的同时，进行切刻置换形成重复单链。

CRISPR技术是一种基因剪切技术，利用Cas蛋白和向导RNA进行组装，通过识别模板序列从而激活Cas蛋白活性实现序列剪切功能。Cas12a是一种RNA向导的蛋白，通过向导RNA和模板序列识别后，可以实现模板链的顺式切割活性和非模板链的反式切割活性，其反式切割活性没有序列特异型，可以是任意一段短单链DNA序列。通过荧光共振转移技术以及Cas12a的反式切割活性可以实现信号放大功能，实现靶标的检测。

环介导等温扩增反应虽然灵敏、快速和方便，但是其反应往往出现假阳性，通过Cas12a探针切割环介导等温扩增产物可以极大减少假阳性率，如HOLMES和DETECTOR方法。但是这些方法对于向导RNA的设计要求极为苛刻，需要在扩增产物上有PAM位点且向导RNA的二级结构序列符合Cas12a蛋白结合序列，这往往和环介导等温扩增反应引物的设计不能兼得，导致设计失败。

发明内容

针对现有技术中裂谷热病毒检测速度慢以及操作复杂的技术问题，本发明提供环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂盒及方法，可以实时检测荧光信号，也可以和市场上商业化试纸条进行联合实现可视化快速检测。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一方面，提供环介导切刻等温扩增引物组，所述引物组包括：如SEQ IDNO.1所示的上游外部引物F3、SEQ ID NO.2所示的下游外部引物B3、SEQ ID NO.3所示的上游内部引物FIP-nick、SEQ ID NO.4所示的下游内部引物BIP-renick和SEQ ID NO.5所示的上游环化引物LF。

所述环介导切刻等温扩增引物组即作为环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组。