[发明专利]环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的引物组、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种环介导切刻等温扩增引物组，其特征在于，所述引物组包括：如SEQ ID NO.1所示的上游外部引物F3、SEQ ID NO.2所示的下游外部引物B3、SEQ ID NO.3所示的上游内部引物FIP-nick、SEQ ID NO.4所示的下游内部引物BIP-renick和SEQ ID NO.5所示的上游环化引物LF。

2.一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，包括：如SEQ ID NO.1所示的上游外部引物F3、SEQ ID NO.2所示的下游外部引物B3、SEQ ID NO.3所示的上游内部引物FIP-nick、SEQ ID NO.4所示的下游内部引物BIP-renick和SEQ ID NO.5所示的上游环化引物LF。

3.根据权利要求2所述一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，还包括环介导切刻等温扩增反应试剂，所述环介导切刻等温扩增反应试剂包括:Bst DNA聚合酶、Mulv逆转录酶、切刻酶、1mM dNTP混合物、1mM dNTPs、20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、50mM KCl、0.1％Tween20和2mM MgSO₄。

4.根据权利要求3所述一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，所述切刻酶选自Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BssSI、Nt.BstNBI、Nb.BtsI或Nt.CviPII中的一种或几种，优选为Nt.BstNBI。

5.根据权利要求2所述一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，还包括用以增加环介导切刻等温扩增终末反应物产量的添加剂，所述添加剂选自二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻糖或PEG8000。

6.根据权利要求2所述一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，所述外部引物F3浓度为0.2μM、外部引物B3浓度为0.2μM、上游内部引物FIP-nick浓度为1.6μM、下游内部引物BIP-renick浓度为1.6μM、上游环化引物LF浓度为0.8μM。

7.根据权利要求2所述一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，还包括CRISPR切割试剂，所述CRISPR切割试剂包括：向导RNA、Cas蛋白、荧光探针、50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mMMgCl₂和100μg/ml BSA。

8.根据权利要求7所述一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，所述向导RNA的序列如SEQ ID NO.6所示；

所述Cas蛋白选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、AacCas12b或Cas14中的一种或几种，优选为LbCas12a；

所述荧光探针的序列为Fam-atatatatat-Dab，其中Fam和Dab分别是荧光基团和淬灭基团。

9.根据权利要求7所述一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，所述CRISPR切割试剂中，所述Cas蛋白的浓度为50-200nM，向导RNA的浓度为100-400nM，Cas蛋白和向导RNA之间的比例在1：1和1：1.5之间，荧光探针的浓度为500nM-1μM。

10.根据权利要求2所述一种环介导切刻等温-CRISPR联合检测裂谷热病毒的试剂盒，其特征在于，还包括裂谷热病毒假病毒作为阳性对照和无核酸酶水作为阴性对照。