[发明专利]用于制备羟基化烃的基于氨基酸被丙氨酸取代的修饰的单加氧酶

说明书

本发明涉及可用于芳烃羟基化的新型单加氧酶。它们特别可用于分别由萘酚和7‑乙氧基香豆素生产1‑萘酚和7‑羟基香豆素。

本发明涉及可用于芳烃羟基化的新型单加氧酶。它们特别可用于分别由萘和7-乙氧基香豆素生产1-萘酚和7-羟基香豆素。

羟基化烃，特别是1-萘酚和7-羟基香豆素，是化学工业中重要的原料。目前，所述化合物通过纯化学方法来生产。目前使用的生产1-萘酚的化学方法主要分为三种类型。在大规模生产中最广泛使用的方法基于萘的氢化、氧化和脱氢。该方法的特征在于高质量和连续生产，但产率低。此外，目前制备萘酚的方法需要酸、碱和金属催化剂。这些化合物可能是昂贵的，或者如果没有适当处理可能引起环境问题。适当的处理可能是额外的成本因素。

生物技术方法对于化学品化合物的合成已经变得更受欢迎。通常，此类方法的特征在于温和的反应条件，因此节省能量，和高特异性，使得形成很少的不期望的副产物。已经从赤红球菌（Rhodococcus ruber）中分离出能够将羟基基团引入到各种芳烃中的P450单加氧酶(Liu等, 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 72: 876-882)。原则上，该酶为制备羟基化芳烃的生物技术方法开辟了途径。然而，野生型酶具有对于经济上可行的生产方法而言不足够的低催化活性。

上述问题通过权利要求书和以下说明书中限定的实施方案来解决。

在第一实施方案中，本发明涉及修饰的P450单加氧酶，其中至少一个选自以下的氨基酸被丙氨酸取代：亮氨酸87、谷氨酸88、赖氨酸89、异亮氨酸90、苏氨酸91、脯氨酸92、缬氨酸93、丝氨酸94、谷氨酸95、谷氨酸96、苏氨酸98、苏氨酸100、亮氨酸101、精氨酸103、酪氨酸104、天冬氨酸105、组氨酸196、苏氨酸197、缬氨酸198、天冬酰胺199、苏氨酸200、色氨酸201、甘氨酸202、精氨酸203、脯氨酸204、脯氨酸206、谷氨酸207、谷氨酸208、谷氨酰胺209和缬氨酸210，其中所述功能性突变导致对芳烃羟基化的反应性提高。

SEQ ID NO. 1定义了原始衍生自赤红球菌的P450单加氧酶的氨基酸序列。“修饰的P450单加氧酶”具有与SEQ ID NO. 1中定义的氨基酸序列相差上文定义的取代中的至少一个的氨基酸序列。

除了本申请中上文和下文列出的序列修饰之外，本发明的修饰的P450单加氧酶的氨基酸序列与SEQ ID NO. 1所定义的野生型酶的氨基酸序列可以具有进一步的差异，条件是这些序列差异不影响其功能，即对芳烃(aromatic carbons)羟基化的反应性提高。本领域技术人员熟知，并非酶的氨基酸序列的所有部分都同等重要。不作为前述区的部分的序列区在许多情况下可以被改变或甚至缺失而不损害蛋白质的酶活性。

因此，本发明还涉及与SEQ ID No. 1所定义的氨基酸序列具有至少90%、更优选至少95%和最优选至少98%序列同一性的蛋白质，条件是此类蛋白质仍然具有提高的对芳烃羟基化的反应性。

本领域技术人员知道，自SEQ ID No. 1添加或缺失氨基酸可以改变本申请中所述的特定氨基酸位置。因此，本申请中基于野生型序列所指的任何氨基酸位置必须理解为是指通过缺失或添加氨基酸衍生自SEQ ID No. 1的蛋白质中的同源氨基酸位置。

具有上述序列同一性程度的SEQ ID No. 1的变体优选仅通过氨基酸的保守取代衍生自SEQ ID No. 1。“保守取代”是在一个氨基酸上被具有相似性质的不同氨基酸取代。优选地，它是将具有非极性侧链的氨基酸换成具有非极性侧链的另一种氨基酸，将具有酸性侧链的氨基酸换成具有酸性侧链的另一种氨基酸，将具有碱性侧链的氨基酸换成具有碱性侧链的另一种氨基酸，或将具有极性侧链的氨基酸换成具有极性侧链的另一种氨基酸。由于保守取代中侧链的性质没有太大变化，因此不会严重影响所得蛋白质的整体结构。