[发明专利]用于制备羟基化烃的基于氨基酸被丙氨酸取代的修饰的单加氧酶

权利要求书

1.修饰的P450单加氧酶，其中至少一个选自以下的氨基酸被丙氨酸取代：亮氨酸87、谷氨酸88、赖氨酸89、异亮氨酸90、苏氨酸91、脯氨酸92、缬氨酸93、丝氨酸94、谷氨酸95、谷氨酸96、苏氨酸98、苏氨酸100、亮氨酸101、精氨酸103、酪氨酸104、天冬氨酸105、组氨酸196、苏氨酸197、缬氨酸198、天冬酰胺199、苏氨酸200、色氨酸201、甘氨酸202、精氨酸203、脯氨酸204、脯氨酸206、谷氨酸207、谷氨酸208、谷氨酰胺209和缬氨酸210，其中所述功能性突变导致对芳烃羟基化的反应性提高。

2.根据权利要求1所述的修饰的P450单加氧酶，其中第209位处的谷氨酰胺被丙氨酸取代。

3.根据权利要求2所述的修饰的P450单加氧酶，其还包括以下取代中的至少一个

a) 第88位处的谷氨酸被选自丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和天冬酰胺的氨基酸取代；和/或

b) 第199位处的天冬酰胺被选自谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸和赖氨酸的氨基酸取代。

4.根据权利要求1所述的修饰的P450单加氧酶，其中第88位处的谷氨酸被丙氨酸取代。

5.根据权利要求4所述的修饰的P450单加氧酶，其还包括以下取代中的至少一个

a) 第199位处的谷氨酸被选自谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸和赖氨酸的氨基酸取代；和/或

b) 第209位处的谷氨酰胺被丙氨酸取代。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的修饰的P450单加氧酶，其在N-末端和/或C-末端具有至多35个氨基酸的添加。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的修饰的P450单加氧酶，其在N-末端和/或C-末端具有至多35个氨基酸的缺失。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的修饰的P450单加氧酶，其中对选自萘、7-乙氧基-羟基香豆素、苊、芴、茚、甲苯和乙苯的至少一种烃具有增加的活性。

9.编码根据权利要求1至8中任一项所述的修饰的P450单加氧酶中的任一种的核酸序列及其互补核酸序列。

10.表达构建体，其包含在调节核酸序列的遗传控制下的权利要求9的核酸序列。

11.载体，其包含权利要求9的核酸序列或权利要求10的表达构建体。

12.微生物，其包含权利要求9的核酸或权利要求10的表达构建体或根据权利要求11所述的载体。

13.根据权利要求12所述的微生物，其中所述微生物属于红球菌属或埃希氏菌属。

14.用于制备权利要求1至8中任一项的修饰的p450单加氧酶的方法，其包括在适于单加氧酶表达的条件下培养根据权利要求12或13所述的重组微生物的步骤。

15.用于芳烃羟基化的方法，其包括以下步骤

a1) 使根据权利要求1至8中任一项所述的修饰的P450单加氧酶中的至少一种与所述芳烃混合并反应，并使所述芳烃由此羟基化；或

a2) 使根据权利要求12或13所述的重组微生物中的至少一种与所述芳烃混合并反应。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述芳烃选自萘、7-乙氧基-羟基香豆素、苊、芴、茚、甲苯、乙苯及其混合物。