[发明专利]中药活性成分靶向筛选方法及试剂盒

权利要求书

1.止咳平喘中药活性成分靶向筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

Step1：在盐酸酸性条件下，将固体基质与亚硝酸钠反应生成重氮盐，其中，所使用的固体基质为羟基化、氨基化、巯基化或羧基化修饰的微球、固体平面或固相萃取微柱；

所述微球选用的是树脂微球或多孔微球；

所述固体平面选用的是纸、硅片或玻璃；

Step2：将his标签重组Im7与Step1生成的重氮盐反应生成Im7亲和基质，其中，Step1生成的重氮盐具体是与his标签重组Im7中his标签的咪唑基发生重氮盐反应；

Step3：利用CL7与Im7之间的超高亲和力，将CL7标签融合GPCRs与Step2生成的Im7亲和基质反应生成中药活性成分靶向筛选介质，具体为：在4℃条件下向Im7亲和基质中加入CL7标签融合GPCRs细胞裂解液反应0.5h，然后用pH＝7.0的5mM乙酸铵缓冲溶液洗涤沉淀多次，之后在4℃条件下离心，去除上清液，沉淀即为中药活性成分靶向筛选介质；

Step4：将待筛选的中药提取液与Step3生成的中药活性成分靶向筛选介质进行孵育，孵育结束后4℃离心，去除上清液，然后用pH＝7.0的20mM乙酸铵缓冲溶液对沉淀进行洗涤，4℃离心分离洗涤液和沉淀，所得洗涤液中含有与GPCRs发生特异性结合的中药活性成分，对所得沉淀在30℃、pH＝7的条件下实施TEV蛋白酶定点酶切，获得高纯度无标签GPCRs和CL7标签修饰的Im7亲和基质；

Step5：在高浓度盐酸胍存在的条件下，对CL7标签修饰的Im7亲和基质进行变性处理，获得CL7肽链和Im7肽链修饰化固体基质；

Step6：用低浓度盐酸胍诱导Im7肽链修饰化固体基质，复性重新获得Im7亲和基质。

2.应用于权利要求1所述的止咳平喘中药活性成分靶向筛选方法中的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由以下材料组成：

(1)Im7亲和基质；

(2)CL7标签融合GPCRs细胞裂解液；

(3)TEV蛋白酶；

(4)盐酸胍；

(5)pH＝7.0的5mM乙酸铵缓冲溶液；

(6)pH＝7.0的20mM乙酸铵缓冲溶液；

(7)超纯水；

其中，所述Im7亲和基质是采用如下方法制备而成：

Step1：在盐酸酸性条件下，将固体基质与亚硝酸钠反应生成重氮盐，其中，所使用的固体基质为羟基化、氨基化、巯基化或羧基化修饰的微球、固体平面或固相萃取微柱，所述微球选用的是树脂微球或多孔微球，所述固体平面选用的是纸、硅片或玻璃；

Step2：将his标签重组Im7与Step1生成的重氮盐反应生成Im7亲和基质，其中，Step1生成的重氮盐具体是与his标签重组Im7中his标签的咪唑基发生重氮盐反应。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的使用方法具体如下：

Step1：在4℃条件下向Im7亲和基质中加入CL7标签融合GPCRs细胞裂解液反应0.5h，然后用pH＝7.0的5mM乙酸铵缓冲溶液洗涤沉淀多次，之后在4℃条件下离心，去除上清液，对沉淀执行Step2；

Step2：向Step1获得的沉淀中加入浓度为1mg/mL的待筛选中药提取液，20℃孵育10min，4℃离心，去除上清液，用pH＝7.0的20mM乙酸铵缓冲溶液对沉淀进行洗涤，4℃离心分离洗涤液和沉淀，对洗涤液进行活性成分鉴定分析，对沉淀执行Step3；

Step3：在30℃、pH＝7的条件下向Step2获得的沉淀中加入TEV蛋白酶进行酶切，4℃离心，留上清液，上清液中含有大量无标签目标受体，对沉淀执行Step4；

Step4：向Step3获得的沉淀中加入超纯水和盐酸胍，使盐酸胍的终浓度为7M，蛋白质变性后在4℃条件下离心，去除上清液，向沉淀中加入超纯水进行复性，重新获得Im7亲和基质。