[发明专利]一种PET系列载体正向测序引物及测序方法在审
申请号: | 201910804905.7 | 申请日: | 2019-08-29 |
公开(公告)号: | CN110616254A | 公开(公告)日: | 2019-12-27 |
发明(设计)人: | 付强;华权高;李立;曾庆耀;曹志雄;舒芹;张雪娇 | 申请(专利权)人: | 武汉金开瑞生物工程有限公司 |
主分类号: | C12Q1/6869 | 分类号: | C12Q1/6869;C12N15/11 |
代理公司: | 42242 武汉蓝宝石专利代理事务所(特殊普通合伙) | 代理人: | 严超 |
地址: | 430000 湖北省武汉市东湖开发区高新大道*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 测序 测序引物 正向 成功率 沉淀 离心收集沉淀 测序反应 基因测序 实验周期 正向引物 测序仪 冷酒精 乙醇 除杂 放入 后向 溶解 节约 配置 | ||
本发明涉及基因测序领域,具体涉及一种PET系列载体正向测序引物及测序方法。本发明所提供的PET系列载体正向测序引物位于T7启动子序列上,长度为20‑25bp。本发明还提供了一种PET系列载体测序方法,包括以下步骤:分别采用上述的正向测序引物配置测序反应体系进行PCR,PCR完成后向体系中加入EDTA/NaAC和冷酒精静置,离心收集沉淀,再用乙醇多次进行除杂沉淀,再溶解沉淀后放入到测序仪中进行测序。本发明所提供的PET序列载体正向测序引物进行测序成功率高,特别是浓度较低的模板,成功率能够明显提高,本发明所提供的利用该正向引物测序的方法,成功率高且节约时间,缩短实验周期。
技术领域
本发明涉及基因测序领域,具体涉及一种PET系列载体正向测序引物及测序方法。
背景技术
在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础,目前用于DNA测序的技术主要有Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法(ChainTermination Method),快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。Sanger测序法已被广泛地应用于对菌、质粒、PCR产物等不同类型的样品所进行的测序技术中,以此提供质粒提取、PCR纯化、测序引物设计、DNA序列的基本数据分析。
PET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统,目的基因被克隆到pET质粒载体上,受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制;表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导,使各种目的蛋白得以最优化表达。PET系列载体是原核蛋白表达引用最多的系统,在任何大肠杆菌表达系统中,基础表达水平最低,所以PET系列载体的质粒样本在DNA测序样本中占有较大的比重,通常会选用测序通用引物进行测序,PET系列载体的通用引物正向为:T7(TAATACGACTCACTATAGGG),反向为:T7-ter(GCTAGTTATTGCTCAGCGG)。
PET系列载体的质粒多为表达质粒,拷贝数相对克隆载体较低,通过质粒小提试剂盒提取的质粒浓度普遍较低,在100ug/ul以下,平均60-80ul/ul左右。使用通用引物测序,正向测序结果往往因为质粒浓度低导致信号弱、无信号,造成测序结果读长短或不可用,成功率低。
发明内容
本发明针对现有技术存在的技术问题,提供一种新的PET系列载体正向测序引物,使用该正向测序引物进行测序成功率高,特别是浓度较低的模板,成功率提高明显,本发明同时提供了一种利用该正向引物测序的方法,成功率高且节约时间。
本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的:
本发明提供了一种PET系列载体正向测序引物,所述正向测序引物位于T7启动子序列上,长度为20-25bp。
优选地,所述正向测序引物序列为5'-GCGAAATTAATACGACTCACTAT-3'。
优选地,所述正向测序引物序列为5'-RAWWKTAATACGACTCACTAT-3'。
优选地,所述正向测序引物序列为5'-RAWWKTAATACGACTCACTA-3'。
优选地,所述正向测序引物序列为5'-WKTAATACGACTCACTATAG-3'。
本发明还提供了一种PET序列载体测序方法,包括以下步骤:采用上述正向测序引物配置测序反应体系进行PCR,PCR完成后向体系中加入EDTA/NaAC和冷酒精静置,离心收集沉淀,再用乙醇多次进行除杂沉淀,再溶解沉淀后放入到测序仪中进行测序。
其中,测序反应体系包括模板1μl、正向测序引物1μl、BigDye mix 2μl、ddH2O 1μl,其中引物的浓度为5pmole/μl。
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- 付强;华权高;李立;曾庆耀;曹志雄;舒芹;张雪娇 - 武汉金开瑞生物工程有限公司
- 2019-08-29 - 2019-12-27 - C12Q1/6869
- 本发明涉及基因测序领域,具体涉及一种PET系列载体正向测序引物及测序方法。本发明所提供的PET系列载体正向测序引物位于T7启动子序列上,长度为20‑25bp。本发明还提供了一种PET系列载体测序方法,包括以下步骤:分别采用上述的正向测序引物配置测序反应体系进行PCR,PCR完成后向体系中加入EDTA/NaAC和冷酒精静置,离心收集沉淀,再用乙醇多次进行除杂沉淀,再溶解沉淀后放入到测序仪中进行测序。本发明所提供的PET序列载体正向测序引物进行测序成功率高,特别是浓度较低的模板,成功率能够明显提高,本发明所提供的利用该正向引物测序的方法,成功率高且节约时间,缩短实验周期。
- 基于线粒体标记的黄鲫群体遗传多样性的评价方法-201910912418.2
- 徐胜勇;蔡珊珊;高天翔 - 浙江海洋大学
- 2019-09-25 - 2019-12-20 - C12Q1/6869
- 本发明提供基于线粒体标记的黄鲫群体遗传多样性的评价方法,属于海洋生物保护领域,包括以线粒体DNA控制区为分子标记,对黄鲫群体的DNA进行PCR扩增,对PCR扩增的产物进行纯化及测序;其中,采用乙醇乙酸钠纯化法对PCR扩增的产物进行纯化,具体步骤包括:在所述PCR扩增产物中依次加入乙酸钠,无水乙醇,氯代十六烷基吡啶,二硫苏糖醇,涡旋振荡,静置,离心,去上清;加入70%乙醇,离心,去上清,室温放置使乙醇自然挥发。本发明能够减少PCR产物损失量,提高测序效率,提高测序结果的准确率,提高黄鲫群体遗传多样性检测结果的可靠性。
- 一种基于碳纳米管和单链DNA复合结构的DNA测序系统-201920266772.8
- 黄显;李亚;徐航 - 天津大学
- 2019-03-01 - 2019-12-20 - C12Q1/6869
- 本实用新型公开了一种基于碳纳米管和单链DNA复合结构的DNA测序系统,包括反应槽,内部配置为装入导电盐溶液及碳纳米管和单链DNA的复合结构;纳米孔测序器件,包括单层或多层薄膜,具有至少一纳米孔,配置为插入导电盐溶液中;电导率测试仪,包含正负电极,其中正负电极配置为插入导盐电溶液中且分别位于支撑薄膜的两侧,该电导率测试仪配置为测量复合结构穿过纳米孔时电导率变化。该系统测序时所产生的信号大于现有技术产生的信号,更易读取,大幅提高了测序的效率和准确率。
- 通过基于结构的探针切割的核酸靶鉴定-201480012991.3
- A.古普塔 - 豪夫迈·罗氏有限公司
- 2014-03-13 - 2019-12-20 - C12Q1/6869
- 本发明提供了用于核酸序列检测的新型方法和组合物。在PCR期间通过聚合酶的5'核酸酶活性产生与靶核酸结合的,来自探针的独特的鉴定性可切割片段。靶的身份可以通过鉴定独特的可切割片段进行确定。
- 具有对齐的纳米级电子元件的含纳米孔的基板及其制备和使用方法-201580075151.6
- J·埃尔登;A·科特斯;A·巴纳德;P·麦可优恩 - 康奈尔大学
- 2015-12-01 - 2019-12-20 - C12Q1/6869
- 含纳米孔的基板包括基板、所述基板上的膜、和设置在所述膜上或嵌入所述膜中的至少一个纳米级电子元件。所述膜限定至少一个纳米孔。所述纳米级电子元件与所述纳米孔中的一个对齐,使得所述纳米级电子元件的边缘和所述纳米孔的边缘之间的最短距离小于50nm。所述纳米孔可通过使用溶液蚀穿介电层,同时相对于所述溶液向所述纳米级电子元件施加电压形成。所述含纳米孔的基板可用于对诸如核酸的生物聚合物进行检测或测序。所述含纳米孔的基板可与生物聚合物检测和/或测序系统一起使用。
- 高通量测序检测人循环肿瘤DNA KRAS基因的捕获探针及试剂盒-201611031539.9
- 李福根;熊磊;金其煌;覃灏 - 上海思路迪生物医学科技有限公司
- 2016-11-18 - 2019-12-17 - C12Q1/6869
- 本发明涉及基于高通量测序检测人循环肿瘤DNA KRAS基因的捕获探针及试剂盒。本发明的人循环肿瘤DNA KRAS基因捕获探针是多种探针的混合物,所述多种探针分别能够捕获人KRAS基因上不同的目标区域。在优选的实施方案中,所述多种探针的集合能够捕获人循环肿瘤DNA KRAS基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域。
- 在固体支持物上的多核苷酸修饰-201480073405.6
- 罗伯托·里加蒂;尼尔·葛姆雷;艾伦·E·埃克哈特;乔纳森·马克·鲍特尔 - 伊鲁米纳剑桥有限公司
- 2014-12-23 - 2019-12-17 - C12Q1/6869
- 本公开内容涉及分子生物学领域,并且更具体地涉及用于在固体表面上捕获和扩增靶多核苷酸的方法。
- 专利分类