[发明专利]一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用

说明书

本发明涉及一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，用于制备基因治疗药物，包括将其与启动子和/或终止序列连接并构建表达质粒。本发明突变体蛋白及其编码核酸具有很高的凝血活性，可以高效地促进血液凝血，提升机体整体凝血功能，具有很好的基因治疗、基因编辑与重组蛋白替代治疗前景。

技术领域

本发明属于出血病治疗领域，特别涉及一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用。

背景技术

凝血因子缺陷或其它人体凝血功能障碍时会导致出血性疾病的发生，其中由于凝血因子VIII/IX(FVIII/FIX)缺陷所导致的出血性疾病称之为血友病(甲型/乙型)，重型病人的凝血因子VIII/IX活性往往低于正常的1％，经常发生自发的出血导致肌肉血肿或者关节畸形。输注因子VIII/IX制剂(目前通常是体外重组表达的凝血因子VIII/IX蛋白)补充患者体内的凝血因子VIII/IX水平是目前唯一有效的治疗方法，但是需要频繁的给药。基因治疗是目前正在临床试验的治疗方法，将正常的凝血因子VIII/IX基因导入患者体内表达，从而达到提高凝血因子VIII/IX水平，预防出血的目的。虽然应用重组或血浆来源的FVIII/FIX可以有效地治疗血友病A和B，但是约有30％的病人在治疗后产生抗体，使治疗失效。旁路凝血活性药物是治疗有抑制物产生血友病患者的最佳选择。但是目前临床上应用的凝血因子VIIa(FVIIa)，由于半寿期短(～2小时)，所需剂量大(90～100μg/kg体重)，治疗成本高昂，因此如何获得具有更好治疗效果和药物代谢特点的新型旁路凝血途径药物是目前血友病治疗的一个亟待解决的问题。

凝血酶原是凝血反应的核心成分，当其被凝血因子X活化成为具有酶活性的凝血酶后，催化裂解纤维蛋白原称为纤维蛋白，使血液凝固从而达到止血的目的。凝血酶在凝血反应的调节中也发挥重要的作用。在血栓调节蛋白(TM)的协助下，凝血酶将蛋白C裂解活化称为活化的蛋白C(aPC)，后者催化灭活活化的凝血因子V和VIII，从而抑制凝血反应的扩增。因此，生理环境下，凝血酶/凝血酶原在凝血反应中发挥着双重功能，既促进血液凝固，又调节凝血反应，抑制过强的凝血反应发生，导致血栓形成。凝血酶在循环中迅速被其抑制物，如抗凝血酶(AT III)灭活，从而使凝血反应终止。

凝血酶原复合物(包括凝血酶原，凝血因子IX,凝血因子X，凝血因子VII)也被应用于血友病，特别是有抑制物存在的血友病的治疗，但是效果并不理想。在血友病患者中应用凝血酶原后，除被活化促进凝血反应外，也可以活化蛋白C，抑制凝血反应，削弱了凝血酶原的止血治疗效果。同时，由于凝血酶会迅速被抗凝血酶灭活，也限制了凝血酶原的在血友病患者中的止血效果。因此，如何对凝血酶原进行改造，使其具有促凝功能的选择性，也即是在保有促进纤维蛋白原转化为纤维蛋白的活性的同时，削弱活化蛋白C抗凝的活性；同时，延长凝血酶的半寿期，对抗凝血酶的抑制能力产生抵抗，也可以提升凝血酶原在出血病中的治疗效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，该突变体凝血活性高，具有很好的基因治疗与重组蛋白替代治疗前景。

本发明提供了一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，应用凝血酶原突变体的核苷酸序列于制备基因治疗药物，包括将其与启动子和/或终止序列连接并构建表达质粒。

本发明还提供了一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，应用突变体蛋白(凝血酶原R541W蛋白)及其编码核酸于基因编辑的病毒、非病毒载体或模板。

本发明还提供了一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，应用突变体蛋白(凝血酶原R541W蛋白)于制备血友病或其他出血性疾病的重组蛋白治疗药物。

本发明还提供了一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，应用突变体蛋白(凝血酶原R541W蛋白)于制备凝血酶原R541W突变体融合蛋白，并将其施用于血友病或其他出血性疾病的重组蛋白治疗药物。

所述融合蛋白为人白蛋白、免疫球蛋白Fc、转铁蛋白或alpha 1抗胰蛋白酶。