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公布日期
2020-09-11 公布专利
2020-09-08 公布专利
2020-09-04 公布专利
2020-09-01 公布专利
2020-08-28 公布专利
2020-08-25 公布专利
2020-08-21 公布专利
2020-08-18 公布专利
2020-08-14 公布专利
2020-08-11 公布专利
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[发明专利]基于RPA技术的樱桃灰霉病菌检测方法及检测专用引物在审

发明公开了一种基于RPA技术的樱桃灰霉病菌检测方法及检测专用引物,所述RPA检测专用引物是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的引物对,用于检测或辅助检测樱桃灰霉病菌,或者制备检测或辅助检测樱桃灰霉病菌用产品。以所述专用引物对从待测植株或病原菌中提取的DNA进行RPA扩增,扩增产物含有296bp的片段,则待测植株或病原菌中含有樱桃灰霉病菌。本发明检测方法操作简便、检测速度快、特异性强、灵敏度高,适合基层对病原菌的快速检测要求,可用于樱桃灰霉病菌的发病前期检测与病害预测预报。

技术领域

本发明属于植物病原真菌的分子检测技术领域,涉及到一种利用重组酶介导等温扩增技术检测樱桃果实中灰霉病菌的方法,以及检测专用引物和试剂盒。

背景技术

樱桃(Cerasus pseudocerasus (Lindl.) G. Don),属蔷薇科Rosaceae李亚科Prunoideae樱属Cerasus,多年生木本果树,起源于我国,栽培历史已达3000余年。樱桃果形娇小、色泽鲜艳、营养丰富、味道鲜美,广受人们青睐,其栽培面积和总产量稳定增长。我国樱桃种植区主要分布在山东、辽宁、河南、山西、陕西、河北、安徽等地区。

随着种植面积的扩大以及种植环境的变化,近年来,樱桃上新出现的病害种类呈上升趋势。尤其是樱桃果实成熟后呼吸代谢旺盛,采摘后几天内就会出现枯梗、果实软化腐烂和风味变淡等,失去其商品和食用价值。并且,樱桃果皮薄且果肉多汁,采摘贮运过程中极易受到多种真菌感染引起病害发生,大大缩短了樱桃的贮藏时间及货架期,进而严重影响樱桃的外观及商品价值,制约樱桃产业的健康可持续发展。

灰霉病是樱桃生产中的主要病害之一,其由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起,在樱桃生长的中后期以及贮藏期发病率高,危害严重。该病菌可危害樱桃的茎叶、花、果实等多个部位,在温湿度适宜时可萌发形成大量的分生孢子,发病处新生的灰霉分生孢子可在一个生长季重复进行多次再侵染,从而导致病情极易扩展传播,加重危害。并且在果实运输或贮藏过程中,由于机械摩擦造成伤口或温湿度及密闭条件控制不当,极易促使病原菌再次繁殖与扩散,造成更大危害。因此,建立一套快速灵敏的检测方法,用于樱桃灰霉病菌的快速检测与早期诊断,对于及时防控病原菌的流行与传播具有重要意义。

植物病原真菌的传统检测办法是先从发病植物组织或周围土壤中分离、纯化获得病原菌,再根据其形态学特征及生物学特性进行分类鉴定。病原菌的分离培养至少需要3~5天时间,耗时费力,且在分离培养过程中极易污染各种杂菌,鉴定准确度较低。更为重要的是,该办法容易遗漏处于潜育期或出现隐症现象的病原菌,从而耽误病害的及时防治。

近年来,分子生物学技术快速发展,为植物病原真菌的快速检测提供了新的思路。应用较多的包括聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR和荧光定量PCR等技术。这些方法均需要经过病原菌分离培养、DNA提取纯化及PCR扩增的过程,操作复杂繁琐、费时费力,需要DNA提取及纯化试剂盒或各种试剂,以及昂贵的PCR仪或特殊仪器设备,并且需要具有一定分子生物学基础及操作技术的专业人员才能完成,无法满足基层检测的需求。

重组酶介导等温扩增(Recombinase Polymerase Amlification,RPA)技术被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外,RPA技术有多重工具酶匹配进行有效扩增,扩增效率远高于传统的PCR技术,所用时间更短,最短可在5min内实现。由于RPA技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点,使其应用越来越广泛。

RPA技术的最大特点是只需要1对引物即可在37℃左右的恒温条件下实现模板核酸的扩增,不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火,因此不需要昂贵的仪器设备。而且37℃的常规反应温度很容易满足,适合基层对病原菌的快速检测。

目前,RPA技术已经广泛应用于人体、动物或植物上的病毒检测,但在植物病原真菌的检测方面,尤其是对于樱桃果实灰霉病菌的RPA检测,未见相关应用报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于RPA技术的樱桃灰霉病菌检测方法,以建立樱桃果实灰霉病菌的快速检测新方法。

提供适用于所述检测方法的检测专用引物,以及含有该专用引物的试剂盒,是本发明的另一发明目的。

为实现上述发明目的,本发明首先针对樱桃灰霉病菌的核糖体转录间隔区(ITS),采用Primer Premier 5.0软件设计了一系列的RPA引物,并通过实验对所设计的引物进行优化筛选,获得了一对用于RPA检测樱桃灰霉病菌的专用引物,其中一条引物包含SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列,另一条引物包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

具体地,所述引物对具有下列所示的核苷酸序列:

上游引物RPA ITS-F:5'-GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGA-3';

下游引物RPA ITS-R:5'-GCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCAT-3'。

本发明所设计的RPA检测专用引物长度在30~35bp,比一般的PCR检测引物长。引物过短会降低重组率,影响RPA反应的扩增速度和检测灵敏度。

进而,本发明提供了上述引物对在检测或辅助检测樱桃灰霉病菌,或者制备检测或辅助检测樱桃灰霉病菌用产品中的应用。

具体地,所述检测或辅助检测樱桃灰霉病菌包括:检测或辅助检测待测植株是否感染樱桃灰霉病菌,以及检测或辅助检测待测病原菌是否为樱桃灰霉病菌。

所述制备检测或辅助检测樱桃灰霉病菌用产品包括:制备检测或辅助检测待测植株是否感染樱桃灰霉病菌的产品,以及制备检测或辅助检测待测病原菌为樱桃灰霉病菌的产品。

进一步地,本发明还提供了一种用于检测或辅助检测樱桃灰霉病菌的RPA试剂,在所述RPA试剂中包括有上述引物对。

优选地,上述RPA试剂中,所述引物对在RPA试剂中的终浓度为0.42μM。

更进一步地,本发明还提供了一种用于检测或辅助检测樱桃灰霉病菌的试剂盒,在所述试剂盒中包括有上述引物对及上述RPA试剂。

本发明所述试剂盒中还包括了RPA反应试剂,所述RPA反应试剂优选采用RAA核酸扩增试剂(基础型,杭州众测生物科技有限公司),包括有复合酶检测干粉,A Buffer和BBuffer。

进而,本发明提供了一种基于RPA技术的樱桃灰霉病菌检测方法,所述方法是从待测植株或待测病原菌中免培养快速提取得到病原菌DNA作为模板,用所述引物对或所述RPA试剂或所述试剂盒进行RPA扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测RPA扩增产物的大小,若所述RPA扩增产物含有大小为296bp的片段,则所述待测植株或待测病原菌中含有樱桃灰霉病菌,若所述RPA扩增产物不含有大小为296bp的片段,则所述待测植株或待测病原菌中不含有樱桃灰霉病菌。

其中,可以采用任何适合的常规DNA提取方法,从待测植株或待测病原菌中免培养快速提取得到病原菌DNA。例如,包括但不限于采用NaOH快速裂解法,从樱桃灰霉病发病果实中提取得到病原菌的DNA。或者,包括但不限于采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒,提取供试病原菌菌株的基因组DNA。

本发明上述方法中,一种优选的RPA扩增反应过程包括:在装有RAA核酸扩增试剂检测干粉的反应单元管中加入A Buffer 41.5μL,10μM的上游引物2μL,10μM的下游引物2μL,模板DNA 2.0μL,B Buffer 2.5μL,盖上管盖,上下翻转混匀5~6次,将RPA扩增体系充分混匀,5,000×g离心10s,置于37℃金属浴上反应30min。

申请号: 201810249149.1 申请日: 2018-03-26
公开/公告号: CN108220475A 公开/公告日: 2018-06-29
申请/专利权人: 山西农业大学
发明/设计人: 王春伟;王燕;余廷濠;荆琦;王芝涵;高海馨;张曦倩;王建明;张作刚;王美琴
主分类号: C12Q1/6895
分类号: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11
搜索关键词: 灰霉病菌 检测 樱桃 专用引物 病原菌 辅助检测 植株 核苷酸序列 快速检测 扩增产物 特异性强 预测预报 灵敏度 可用 扩增 引物 制备 病害 基层
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