[发明专利]一种利用LAMP引物组定量快速检测原料乳中产耐热蛋白酶的荧光假单胞菌方法

说明书

本发明公开一种原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的LAMP检测引物组及方法，属于食品安全检测领域。发明以荧光假单胞菌蛋白酶基因为检测靶基因，设计和筛选了一套特异性的引物组，以及适用于该引物组的LAMP检测体系和反应条件。现有的传统检测方法用时长，耗费人力物力，本发明采用的检测方法检测限低，特异性强，用时短；而且成本低，操作过程简单，反应过程中无需昂贵的仪器设备；结果判定方面肉眼即可鉴定。该发明在一定程度上解决了传统方法的弊端，对于快速检测原料乳的品质具有重要意义，该方法适合于基层在线监测和现场检测使用。

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种原料乳中产耐热蛋白酶的荧光假单胞菌的检测引物组及检测方法。

背景技术

自十九世纪五十年代低温保存技术的出现，原料乳的冷藏和低温保存成为了保障品质的一个必要的技术环节。乳酸菌和其他嗜温菌引起的原料乳酸化现象大大减少，乳制品的生物学品质也得到了极大的提高。但是，低温条件下的长时间贮藏对于原料乳中微生物种群的结构产生重大影响。在原料乳最初的冷藏阶段，革兰氏阳性嗜温好氧菌占主导地位，随着时间的延长，逐渐被嗜冷菌所取代；尤其是在来自卫生条件差农场的原料乳和含有较多体细胞的原料乳中，这种现象更加显著。冷藏原料乳中嗜冷菌的比例占到总微生物的90％。虽然多数嗜冷菌在原料乳的常规热处理过程中已经死亡，即使尚有残留活菌体也不足以危及乳制品的货架期，但是嗜冷菌能够分泌大量胞外的耐热蛋白酶，这些蛋白酶即使经过高温处理，仍会留有残余。残余的耐热蛋白酶在乳制品储藏的过程中持续分解蛋白质。。蛋白酶主要将κ-酪蛋白水解成副-κ-酪蛋白，使κ-酪蛋白无法发挥稳定蛋白质的性能，导致蛋白质集中，最后蛋白质受到重力逐渐下沉到底部，这个过程中乳清不断排出，出现凝胶。大部分嗜冷菌分泌的胞外蛋白酶能够一定程度上耐受热处理，在140℃下的D值为2～300s。嗜冷菌分泌的耐热蛋白酶在乳中能够较强的复原活性。经过热处理后，未彻底失活的蛋白酶在温度降低阶段中，逐渐再次折叠成有分解能力的原始结构。一旦原料乳中该类酶的数量过多，简单的热处理无法保证乳制品品质。UHT乳和奶油等货架期较长的乳制品出现的涩味与耐热蛋白酶水解肽链有关。通常，UHT乳的保质期为常温条件下数月，受到耐热蛋白酶的影响较为严重。热处理后残留的蛋白酶活性甚至可使待加工的乳在贮存过程中发生交联，无法用于奶酪等乳制品加工。作为原料乳中最常见的嗜冷菌，检测原料乳中产耐热蛋白酶的P.fluorescens能够衡量原料乳的品质。

目前国际标准的乳品嗜冷菌计数方法为IDF Standard 101A和IDF Standard132A，前者是将原料乳在6.5℃培养10天，然后进行平板计数；后者是将原料乳在21℃培养25h，然后进行平板计数。前者的试验周期太长；后者虽然试验周期短，但是结果并不十分准确。两种方法均不能满足基层在线监测和现场检测的要求。

近年来，不少学者对原料乳中嗜冷菌的检测方法进行了研究，其中包括PCR法和荧光原位杂交法。PCR方法虽然具有较低的检测限，但是容易受到其他乳中微生物的干扰，检测的特异性不强。荧光原位杂交方法的检测用时较长，约6～7h，并且容易受到染料的干扰。这两种检测方法都对操作人员的试验技能有一定要求，而且PCR检测需要大型贵重仪器，限制了检测方法的使用范围，无法应用于现场检测。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)针对靶基因的6个区域设计4条特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件(65℃左右)孵育几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速的特点。LAMP可在1h之内，将靶基因扩增109-1010倍。在DNA不断延伸合成的同时，脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)析出的焦磷酸离子与反应溶液中的Mg2+结合，大量产生一种焦磷酸镁的衍生物，该衍生物可以与显色剂SYBR Green I反应，发生颜色变化，肉眼即可判定检测结果。该方法检测特异性强，检测限低，并且所用仪器设备简单，具有应用于现场检测的潜力。但是在应用于原料乳中产耐热蛋白酶的P.fluorescens的检测方面还未见报道。