[发明专利]蓝藻蛋白多肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白多肽的提取领域，具体是一种蓝藻蛋白多肽的制备方法。

背景技术

水体富营养化程度的加剧和范围的扩大，致使淡水蓝藻水华爆发日趋普遍，严重破坏水体及周围环境，为消除蓝藻污染，每年大量的蓝藻被打捞上来，与此同时打捞上来的蓝藻的资源化利用已成为蓝藻重点研究课题。

蓝藻中含有有效物质包括氨基酸、多糖、藻胆蛋白、藻毒素，一吨蓝藻藻干粉可生产藻蓝蛋白SO-80kg,藻多糖20kg,藻毒素lkg。其中，藻毒素包括微囊藻毒素(microcystin，MC)、节球藻毒素(nodularin，NOD)、柱胞藻毒素(cylindrospermospin)、鱼腥藻毒素-α(anatoxin-α)等。试剂级蓝藻蛋白售价达150~180美元/毫克，是黄金价格的10000倍，但目前市场全部被美国垄断。目前国内主要采用螺旋藻等原料提取藻蓝蛋白，但是螺旋藻中藻蓝蛋白含量较低且其本身作为保健品市场价格很高，因此提取成本较高。如何提高蓝藻蛋白的提取率和如何充分地去除蓝藻蛋白中的藻毒素是目前研究重点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备方法简单、重现性好、制备成本低廉、提取率高的蓝藻蛋白多肽的制备方法，制备得到的蓝藻蛋白中MC-LR含量极低，达到试剂级标准。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：蓝藻蛋白多肽的制备方法，包括冻融破壁、分级盐析、双水相萃取、超滤纯化和吸附除藻毒素。采用本发明方法制备方法简单、重现性好、制备成本低廉，提取蓝藻蛋白多肽提取率高，纯化及其去除MC-LR过程中蓝藻蛋白的损失量少，最后得到的蓝藻蛋白多肽中MC-LR含量极低，达到试剂级标准。

冻融破壁为：在蓝藻泥中加入超纯水，蓝藻泥和超纯水的质量体积比为1g：0.6~2.0ml，于-25~-15℃温度下冷冻，于15~25℃温度下解冻，反复冻融次数1~3次，冻融结束后2~6℃温度下8000~12000r/min离心6~15min，保存上清液。冻融破壁的方法其条件比较温和，不易造成蛋白质变性，它利用冷冻条件下细胞内形成的冰粒以及细胞液的盐浓度增高而引起的溶胀从而使细胞破碎蛋白溶出。上述冻融操作为最优选，冻融温度的改变或冻融次数的改变均会对蓝藻蛋白活性或提取率产生不良影响。

分级盐析为：在冻融破壁得到的上清液中加入硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度达到15~25%，搅拌，2~6℃温度下4000~6000r/min离心3~8min，取沉淀，在沉淀中加超纯水溶解加入硫酸铵使溶液中硫酸铵饱和度达到30~40%，搅拌，2~6℃温度下4000~6000r/min离心3~8min，取上清液。15~25%和30~40%硫酸铵饱和度组合，通过两步盐析可以将纯度为0.64~0.82的蓝藻蛋白粗提液提纯得到纯度为3.51~4.05的蓝藻蛋白浓缩液，蛋白得率由5.61~5.83%降到4.84~5.06%。

双水相萃取为：在分级盐析得到上清液中加入PEG4000和磷酸钾盐KHP，调节体系pH为5.5~6.5，PEG4000浓度为12~20%, KHP浓度为10~15%，400~800r/min搅拌，转移至分液漏斗中分层，取下相，得到蓝藻蛋白多肽溶液。由于蓝藻蛋白的等电点(pI)为5.8，当体系pH为5.5~6.5时，蓝藻蛋白分子表面所带的电荷被中和(或非常少)，此时净电荷的影响可以忽略不计，影响蓝藻蛋白分配的主要是其表面性质，蓝藻蛋白富集于聚乙二醇相中而其他杂质则分配到无机盐相中。

超滤纯化为：将双水相萃取得到的蓝藻蛋白多肽溶液转移到超滤离心管中，2~6℃温度下8000~12000r/min离心8~15min，得到粗制蓝藻蛋白多肽；所述超滤离心管规格为20~40KDa。

吸附除藻毒素为：将粗制蓝藻蛋白多肽用超纯水溶解，加入氧化石墨烯粉末，2~6℃温度下200~600r/min搅拌吸附12~24h，2~6℃温度下8000~12000r/min离心6~15min，取上清液，冷冻干燥得到精制蓝藻蛋白多肽。本发明的氧化石墨烯粉末具有较大的中孔体积、巨大的比表面积和复杂而发达的孔隙结构，孔隙中均匀分布有纳米硅酸盐类物质和氯化钾，表面经过盐酸改性，其特殊的结构对MC-LR具有特异性和选择性，水中的NOM与MC-LR不存在竞争吸附，MC-LR的去除率高。