[发明专利]快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法

说明书

本发明公开了快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法。本发明提供了种检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP的方法，包括如下步骤：1)制备一段单链DNA分子和与其互补的杂交单链；所述单链DNA分子中从5‘至3’方向上包括依次排列的相邻的碱基乙和碱基甲；2)将所述单链DNA分子、所述杂交单链、所述特定结构dNTP和待测DNA聚合酶放在体系里进行DNA聚合反应，检测是否能成功聚合。本发明的检测方法具有如下优点：适用范围广、无污染、可行性、通量灵活，高通量。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法。

背景技术

随着测序技术的不断发展，所使用的dNTP结构被不断的改造：边合成边测序技术使用的dNTP的3'-OH被可切除的阻断基团封闭，且碱基上还加入了一个可切除的荧光基团；PacBio的单分子测序使用的dNTP是3'-OH自由但5'-磷酸基团修饰有荧光基团；还有些新型的dNTP分子在继续被开发和应用于测序技术中。这些都要求DNA聚合酶也需进行相应的改变才能继续行使聚合功能。实际上，DNA聚合酶已经是测序技术中的一个决定性的因素。因此针对不同种类的特殊构造dNTP,需要开发出一种快速简单的从大量的突变体中筛选出合适的DNA聚合酶的方法。

现有技术主要用于检测或筛选对自然dNTP进行聚合的DNA聚合酶，而对应用于测序技术中的结构特殊的dNTP的应用非常有限，只能用于能聚合3'-羟基自由且没有荧光标记的dNTP的DNA聚合酶的筛选，不能用于聚合3'-羟基连接有修饰基团或有荧光标记dNTP的DNA聚合酶的筛选，因为3'-羟基不自由的dNTP不能被连续的聚合产生可被检测的双链DNA，而有荧光标记的dNTP会影响picogreen染料与底物结合产生的荧光，导致检测结果不准确。

由于特殊构造的dNTP是随着测序技术的发展而快速发展和应用的,目前对可用于聚合特殊构造的dNTP的DNA聚合酶的筛选方法并不完善。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP的方法，包括如下步骤：

1)制备一段单链DNA分子和与其互补的杂交单链；

所述单链DNA分子中从5‘至3’方向上包括依次排列的相邻的碱基乙和碱基甲，所述杂交单链与所述单链DNA分子互补时还需满足如下条件：所述杂交单链3'末端的核苷酸与所述单链DNA分子上的碱基甲互补，所述碱基乙与待聚合特定结构dNTP互补；

2)将所述单链DNA分子、所述杂交单链、所述特定结构dNTP和待测DNA聚合酶放在体系里进行DNA聚合反应，并且以所述单链DNA分子作为延伸模板，检测是否能成功聚合，若能成功聚合，则待测DNA聚合酶能聚合特定结构dNTP，若不能成功聚合，则待测DNA聚合酶不能聚合特定结构dNTP。

上述特定结构dNTP为荧光修饰dNTP、无荧光修饰且3’端阻断dNTP或无荧光修饰且3’端自由dNTP；

上述方法中，所述检测是否能成功聚合的方法如下：

(1)当所述特定结构dNTP为荧光修饰dNTP，若聚合反应有荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合所述荧光修饰dNTP；

若聚合反应无荧光信号，则所述待测DNA聚合酶不能聚合所述荧光修饰dNTP；

所述聚合反应的信号越强，说明待测DNA聚合酶对荧光修饰dNTP的聚合能力越强。

(2)当所述特定结构dNTP为无荧光修饰且3’端自由dNTP，向聚合反应后的体系中加入带有荧光的另一dNTP和已知能聚合所述另一dNTP且无外切活性的聚合酶，进行二次聚合反应，检测二次聚合反应的荧光信号，若二次聚合反应有荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合该所述无荧光修饰且3’端自由dNTP；