[发明专利]快速检测和筛选能聚合特殊构造dNTP的DNA聚合酶的方法

权利要求书

1.一种检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP的方法，包括如下步骤：

1）制备一段单链DNA分子和与其互补的杂交单链；

所述单链DNA分子中从5‘至3’方向上包括相邻排列的碱基乙和碱基甲，所述杂交单链与所述单链DNA分子互补时还需满足如下条件：所述杂交单链3'末端的核苷酸与所述单链DNA分子上的碱基甲互补，所述碱基乙与待聚合特定结构dNTP互补；

2）将所述单链DNA分子、所述杂交单链、所述特定结构dNTP和待测DNA聚合酶混合进行DNA聚合反应，并且以所述单链DNA分子作为延伸模板，检测是否能成功聚合，若能成功聚合，则所述待测DNA聚合酶能聚合所述特定结构dNTP，若不能成功聚合，则所述待测DNA聚合酶不能聚合所述特定结构dNTP；

所述检测是否能成功聚合的方法如下：

（1）当所述特定结构dNTP为荧光修饰dNTP，若聚合反应有荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合所述荧光修饰dNTP；

（2）当所述特定结构dNTP为无荧光修饰且3’端自由dNTP，向聚合反应后的体系中加入带有荧光的另一dNTP和已知能聚合该另一dNTP且无外切活性的聚合酶，进行二次聚合反应，检测二次聚合反应的荧光信号，若二次聚合反应有荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合该所述无荧光修饰且3’端自由dNTP；

所述带有荧光的另一dNTP与所述单链DNA分子中的碱基丙互补配对，所述碱基丙位于所述碱基乙的上游且与所述碱基乙相邻，且所述碱基丙和所述碱基乙不同；

（3）当所述特定结构dNTP为无荧光修饰且3’端阻断dNTP，向聚合反应后的体系中加入带有荧光的另一dNTP和已知能聚合该另一dNTP且无外切活性的聚合酶，进行二次聚合反应，检测二次聚合反应的荧光信号，若二次聚合反应无荧光信号，则所述待测DNA聚合酶能聚合该所述无荧光修饰且3’端阻断dNTP；

所述带有荧光的另一dNTP与所述单链DNA分子中的所述碱基乙互补配对。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述聚合反应均在固定相上完成；

和，所述固定相具体为芯片。

3.根据权利要求1-2中任一所述的方法，其特征在于：

所述无外切活性的聚合酶为无3'-5’外切活性且高度保守的DNA聚合酶。

4.根据权利要求1-2中任一所述的方法，其特征在于：

所述单链DNA分子大小为10-200nt。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述单链DNA分子大小为15-150nt。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述单链DNA分子大小为20-100nt。

7.根据权利要求1-2中任一所述的方法，其特征在于：

所述特定结构dNTP中的dNTP为如下中至少一种：dATP、dTTP或dUTP、dCTP和dGTP；

若特定结构dNTP为多种dNTP，则制备多条杂交单链，且一种特定结构dNTP对应一条杂交单链。

8.权利要求1-7中任一所述的方法中的所述单链DNA分子、所述杂交单链、所述已知能聚合另一dNTP且无外切活性的聚合酶和所述带有荧光的另一dNTP在检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

所述特定结构dNTP为荧光修饰dNTP、无荧光修饰且3’端阻断dNTP或无荧光修饰且3’端自由dNTP。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述dNTP为如下中至少一种：dATP、dTTP或dUTP、dCTP和dGTP。

11.一种检测待测DNA聚合酶能否聚合特定结构dNTP的试剂盒，包括权利要求1-7中任一所述的方法中所述单链DNA分子、所述杂交单链、所述特定结构dNTP和所述已知能聚合另一dNTP且无外切活性的聚合酶。