[发明专利]提高母体外周血中胎儿游离DNA浓度的试剂盒、装置及方法

权利要求书

1.一种从母体外周血中获得高浓度胎儿游离DNA的方法，包括如下操作：

1)从母体外周血中分离血浆并提取其中的游离DNA；

2)通过构建文库对游离DNA进行扩增，具体操作为：

末端修复：将上一步提取获得的游离DNA 分别按照下面的表格配置反应体系；

将此反应体系置于室温孵育20min；使用AMPure XP磁珠进行纯化，25μL TE溶液溶解洗脱；

接头连接：将上步所得的平末端DNA分别按照下面的表格配置反应体系：

所述P1接头为由如下两个正反序列组成的P1 Adapter：

5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'，

3'-T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5'

所述标签序列X是由如下正反两个序列组成的Barcode Primer X组成：

5'-CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3'

3'-CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'

其中“N”代表A、T、C、G任意一个碱基； *代表核苷酸进行了硫代修饰，防止被核酸酶降解；

将此反应体系置于室温孵育30min；使用AMPure XP磁珠进行纯化，18.2μL TE溶液溶解洗脱；

PCR扩增：将上步所得的连接接头的DNA按照下面的表格配置反应体系

所述PCR引物序列为：

Primer 1：5 ' -CCATCTCATCCCTGCGTGTC- 3 '

Primer 2：5 ' -CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG -3'

PCR 反应条件： 72℃， 10min， 95℃， 5min；然后 95℃， 15s， 62℃， 15s， 70℃，1min， 12 个循环； 70℃， 5min； 4℃， holding；

PCR结束后，用AMPure XP磁珠进行纯化，30μL TE溶液溶解洗脱；

3)及文库片段筛选，具体包括：

a)将进行筛选的文库DNA 加入1.5倍体积的筛选磁珠，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

b)将上清吸取至1.5倍体积的筛选磁珠中，将上清和磁珠充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

c)吸走上清，使用75%～80%乙醇洗涤2次后，使用20μL TE溶液溶解洗脱，得到筛选后的DNA文库；

或

a)将进行筛选的文库DNA 加入1倍体积的筛选磁珠，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

b)将上清吸取至1.5倍体积的筛选磁珠中，充分混合后静置5分钟，置于磁力架上直至澄清；

c)吸走上清，使用75%～80%乙醇洗涤2次后，使用20μL TE溶液溶解洗脱，得到筛选后的DNA文库；

其中，所述文库片段筛选用于富集游离DNA中片段长度区段为 [115-125)、[105-125)、[115-135)或[105-135)的游离DNA片段。