[发明专利]大肠杆菌表达的rhFGF7蛋白及应用

说明书

技术领域

本发明属分子生物学领域，具体涉及大肠杆菌表达的Halo-tag-rhFGF7蛋白及制备治疗急性肝损伤药物中的应用。

背景技术

成纤维细胞生长因子-7（FGF7）是成纤维细胞生长因子家族成员之一，1989年由Rubin等人从人胚胎性肺成纤维细胞首先分离到的。FGF7是一种由间质细胞分泌、以上皮细胞为靶细胞的肝素结合性细胞因子。它只与FGFR2IIIb型受体特异性结合^[2],继而引起胞内一系列信号传递和基因表达，在上皮细胞的生长、分化、迁移等过程中起重要作用。随后的研究发现，该蛋白在上皮组织发育和损伤的预防、修复及肿瘤的发生^[8]中发挥重要的生物学作用。FGF7促进上皮细胞生长和分化，对肝脏细胞也有强大的影响。证明激活后的HSC表达的FGF7对刺激肝细胞生长因子信号通路和调节肝再生有促进作用。体外实验证明FGF7可以抑制肝细胞调亡，对肝细胞有暂时的保护作用。Bohm等人（2010）报道，重组FGF7的使用可以增加肝组织手术切除处理后的存活率。

FGF7具有组织特异性高、致癌作用低、生物活性强等优点，其重组蛋白产品（商品名为Palifermin）已被美国 FDA 批准用于治疗放化疗引起的急性口腔黏膜炎。FGF7还有很多潜在应用，如治疗糖尿病等代谢性疾病引起的慢性伤口、治疗早产儿的表面活性剂不足和支气管肺发育不良（BPD）、治疗急性肺损伤、急性肝损伤等，均显示了较好的前景。鉴于FGF7在研究和应用方面有重要意义，研究者们围绕FGF7表达进行了大量的工作。重组FGF7及其突变体曾在大肠杆菌和哺乳动物细胞CHO及植物中表达，但是仍存在一定的问题。这些重组FGF7蛋白在表达中表现出对宿主菌的毒性、表达量低、稳定性差、易降解等问题，从而限制了相关机制深入研究和药物研发的进程。前期研究表明，利用Halo-tag与蛋白融合表达，获得高产量。Halo-tag 是分子质量单位为33 kDa的蛋白标签, 由微生物紫红红球菌的脱卤素酶演化而来，该酶可与合成配体共价结合。Halo-tag 可以在原核表达系统（大肠埃希菌表达系统）或真核表达系统中与目的蛋白的N端或C端融合表达且不破坏目的蛋白功能。

发明内容

本发明的目的是为了提高成纤维细胞生长因子-7的活性，而提供一种重组成纤维细胞生长因子-7Halo-rhFGF7。

重组的成纤维细胞生长因子Halo-rhFGF7基因，它的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

重组的成纤维细胞生长因子Halo-rhFGF7蛋白，它是碱基序列如SEQ ID NO.1所示的基因表达的蛋白；

表达载体pET14b-Halo-rhFGF7，它是在表达载体中插入了碱基序列如SEQ ID NO.1所示的基因；

一种大肠杆菌工程菌，它是上述的表达载体pET14b-Halo-rhFGF7转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态中。

重组的成纤维细胞生长因子rhFGF7，它是由下述方法制备的：

1）将上述的一种大肠杆菌工程菌，在30mL含氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中以37℃、180 rpm的条件进行培养。当OD600达到0.8-1.0时，将培养物转移到300mL含胰蛋白胨（10g/L），酵母粉（10g/L），KH2PO4（1g/L），K2HPO4（3g/L），氯化钠（4g/L）的改良培养基中并以180rpm、37℃为条件进行振荡培养；收集的菌体重悬于裂解缓冲液，收集上清；

2）洗脱、纯化；

3）用rTEV蛋白酶酶解、纯化，得rhFGF7。

重组的成纤维细胞生长因子Halo-rhFGF7或重组的成纤维细胞生长因子rhFGF7制备治疗急性肝损伤药物中的应用。

本发明提供了重组的成纤维细胞生长因子Halo-rhFGF7基因，插入表达载体pET14b中，构建表达载体pET14b-Halo-rhFGF7， 转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态中；进行培养；收集的菌体重悬于裂解缓冲液，收集上清；洗脱、纯化得Halo-rhFGF7；用rTEV蛋白酶酶解、纯化，得rhFGF7。实验证明重组的成纤维细胞生长因子Halo-rhFGF7和重组的成纤维细胞生长因子rhFGF7，对BaF3细胞和L-O₂细胞的促增殖作用，缓解CCL4损伤L-O2细胞的作用，保护肝细胞急性损伤的信号通路方面均高于rhFGF7标准品；细胞毒性也有所降低。

附图说明：