[发明专利]一种制备基于蛋白A突变体的结合蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备具有新的特异性结合能力的异源多聚体蛋白A突变体的方法。本发明提供编码所述异源多聚体蛋白A突变体的核苷酸文库和对应的蛋白质文库，揭示了从所述突变体文库中筛选对预定靶分子具有结合能力的蛋白A突变体的方法，分离编码所述蛋白A突变体的核苷酸的方法，鉴定和分析所述蛋白A突变体的方法，以及生产所述蛋白A突变体的方法。此外，本发明进一步提供能以高亲和力特异性结合到预定靶分子上的、以异源多聚体蛋白A为基础的新的结合蛋白质。

背景技术

抗体能够特异性识别和结合各类外源性物质，如小分子化合物、花粉、病毒、细菌等半抗原和抗原。在抗体分子Y型的两个分叉顶端，各有一个由六条环状多肽构成的互补区域(CDR)形成锁状结构，这些部位的氨基酸通过氢键、范德华力、电荷作用和疏水作用，与抗原表面的表位形成非共价键相互作用。在抗体基因中，编码抗原结合部位的DNA可以随机组合和突变，这一高变区的氨基酸可以发生非常丰富的变化，每一种特定的变化，可以赋予抗体具有和某一预定抗原相结合的能力。

随着基因重组技术、蛋白质工程和重组抗体库体外亲和筛选技术以及结构生物学的发展，越来越多的抗体三维晶体结构得到解析，抗体结合抗原的分子机理得到更好理解。抗体的局限性，比如分子量大、结构复杂等，促使研究者将来源于抗体CDR区域的“结合区域”这一概念，移植到一些非常稳定的非抗体类的蛋白(如本发明用到的异源多聚体蛋白A)表面。将这些蛋白表面的某些邻近的氨基酸高度突变，可以人为的塑造出适当的结合区域，从而赋予这些蛋白与各类预定靶分子结合的能力。

WO 95/19374描述了以蛋白A的一个结构域单体为基础的结合蛋白(Affibody)的产生。蛋白A是来源于金黄色葡萄球菌细胞表面的一种蛋白质，由5个高度同源的结构域组成，其结合许多哺乳动物物种(包括人)的免疫球蛋白。由于蛋白A单个结构域的分子量非常小(约6kDa)，其表面能提供的结合区域的面积相对较小，限制了其结合能力。根据已有技术信息，WO 95/19374中产生的结合蛋白的亲和力K_D范围通常在10^-6-10^-8M范围，多数情况下在10^-7M，例如初筛得到的结合EGFR的结合蛋白的亲和力在130nM-185nM，结合H-Ras的结合蛋白的亲和力在79nM-283nM，结合rVIII的结合蛋白的亲和力在100nM-200nM。在此外，蛋白A单个结构域的结合区域由两个并列的α螺旋一侧的氨基酸构成，形成了一个扁平的结合面，这也限制了其能结合的靶分子表位的类型。

发明内容

本发明的目标是提供具有更高结合能力的、能够普遍的识别更多不同类型的靶分子表位的多聚体蛋白A突变体的方法。本发明的进一步目标是提供以新颖的异源多聚体蛋白A为基础，通过初始筛选，即可普遍制备高亲和力结合蛋白的方法。

更具体地，本发明提供了一种制备具有新的特异性结合能力的异源多聚体蛋白A突变体的方法，包括下列主要步骤：

提供单体经过修饰的蛋白A的异源多聚体突变体的库，所述库包括异源多聚体蛋白质，所述异源多聚体蛋白质包括两个或更多以首尾排列的方式连接在一起的蛋白A单体，其中所述异源多聚体蛋白质的至少两个所述单体是通过对位于SEQ ID No：1中的9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35处的至少五个氨基酸的替换而进行的修饰，所述修饰的单体蛋白质与未修饰的蛋白A具有至少80％的氨基酸序列一致性；

为所述经过修饰的蛋白A的库提供潜在的靶分子；

使所述修饰的蛋白质的库与所述靶分子接触；

通过筛选方法得到异源多聚体蛋白A突变体。

用于该申请中重要的术语的定义

术语“蛋白A单体”是指蛋白A的一个结构域蛋白，包括与SEQ ID NO:1完全一致的，或者氨基酸序列一致性超过80％的蛋白质。

本说明书中，术语“异源多聚体蛋白”是包含两个或更多不同修饰的蛋白A单体的蛋白质。因此，本发明的“异源多聚体”具有两个独立的结合区域的至少两个不同修饰的蛋白A单体的融合蛋白，优选为异源二聚体或异源三聚体。