[发明专利]提高大豆耐旱和抗除草剂性能的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用转基因技术获得耐旱大豆新材料的方法。

背景技术

大豆原产于中国，栽培历史悠久，是蛋白质和油料的主要来源之一。干旱、盐害等非生物胁迫对大豆的生产影响较大，因此，开展大豆抗旱胁迫相关基因的功能研究，对揭示大豆抗旱机理、培育大豆抗旱品种具有重大的理论和应用价值。我国大豆主产区主要分布在干旱、盐碱、高寒地区。严峻的生长环境特别是干旱和土壤盐碱化给我国大豆生产带来严重威胁。据不完全统计，每年因干旱和盐碱化造成的大豆产量损失达到50％左右。因此，如何有效降低干旱、盐碱等非生物逆境对大豆等农作物影响，对于提高大豆粮食总产，缓减我国大豆危机具有重要的意义。

目前，抗旱大豆新品种的培育主要是通过常规育种方法进行，但由于缺乏高效的抗旱大豆种质资源，利用常规技术进行抗旱大豆新品种培育较为困难，而且常常难以和产量、品质等性状进行综合协调改良。利用转基因技术培育抗旱转基因大豆新种质，一方面突破了不同物种间的生殖隔离，一些极度抗旱植物如柳枝稷、盐地碱篷、盐芥以及一些特殊生境微生物的有利抗性基因也可以通过转基因技术导入大豆中，从而极大地拓宽了抗旱、耐盐碱大豆新品种培育所必需的抗性遗传资源。另一方面，转基因技术实现一个或少数几个有利基因的定向导入，从而有效解决了产量、品质、抗性等性状综合改良的问题。因此，通过转基因技术和常规育种的有效集成，是解决我国抗旱大豆育种困难，提升我国大豆科研育种水平的重要手段。

随着转基因技术的不断发展，越来越多的转基因作物实现了产业化。但是单性状的转基因作物已经慢慢的无法满足农业发展的需求，而复合性状转基因作物拓宽了转基因作物的功能，提高了资源的利用率，满足了农民多元化需求，具有广阔的应用前景，是转基因植物发展的新方向。复合性状转基因作物是指同一种转基因植物中含有两种及两种以上的不同目标性状。比如同时耐除草剂和抗虫的转基因棉花，同时抗病和抗虫的转基因马铃薯，含油量高和耐除草剂的转基因大豆，同时改变花色和耐除草剂的转基因香石竹，同时增加赖氨酸含量和抗虫的转基因玉米等都是复合性状转基因作物。多性状聚合是转基因作物发展的趋势。据统计到2010年，美国种植的转基因作物中41％具有复合性状，包括78％的转基因玉米以及67％的转基因棉花。

在本项研究中，发明人将从可食性真菌Flammulina velutipes中克隆的C-5固醇脱氢酶基因(FvC5SD)转入大豆中，旨在有效的提高大豆的抗旱性，此外，选用的双元表达载体上含有除草剂草胺膦标记基因bar，因此我们得到了具备耐旱和抗除草剂复合性状的转基因大豆，通过进一步优化实验步骤，形成了一种利用转基因技术提高大豆耐旱性和抗除草剂性能的方法。其中前人已经将FvC5SD基因转入番茄，获得了耐旱的转基因番茄，但是未见有将FvC5SD基因转入大豆中的报道。

发明内容

本发明提供获得具备耐旱和抗除草剂复合性状的转基因大豆方法，可以有效的促进大豆产业的发展。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

提供一种含有FvC5SD基因的植物表达载体pYL-FvC5SD，该表达载体是通过对基础载体pYL进行SpeI和SacI双酶切，将FvC5SD基因cDNA序列克隆到基础载体pYL的T-DNA区多克隆位点而得到。该表达载体含有一个筛选基因bar，一方面有利于转化体的筛选，减小后期检测工作量，通过检测bar基因来进一步证明目的基因已转入受体植株。另一方面可以使后代转基因植株中同时具备抗除草剂的功能。

提供一种转FvC5SD基因耐旱大豆的培育方法，该方法先将FvC5SD基因克隆构建至表达载体pYL中，再利用根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法将FvC5SD基因转入大豆受体品种Williams82的基因组中，最终得到耐旱转基因大豆材料。但是本实验提供的方法不仅限于此，任何一种转化方法能将本发明提供的重组表达载体导入大豆基因组中都适用。

所述转FvC5SD基因耐旱大豆的培育方法，包括如下步骤：

(1)农杆菌介导的大豆遗传转化：将含有FvC5SD基因的植物表达载体pYL-FvC5SD，利用根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法导入大豆受体品种的基因组中，获得T0代转化植株；

(2)转FvC5SD基因大豆材料的筛选：应用bar试纸条检测、草胺膦除草剂涂抹、FvC5SD基因PCR扩增等方法对T0代转化植株进行筛选鉴定，获得阳性植株。进行自交获得T1代种子；对T1代阳性植株进行分子检测；