[发明专利]增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法及其菌株和应用

说明书

本发明涉及植物病理学技术领域，具体涉及一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法及其菌株和应用。本发明提供的一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法构建了mig2－5－1启动子调控EGFP表达的载体PHD3－mig2－5－1－EGFP，利用原生质体遗传转化法将载体转入玉米丝黑穗菌内，并且采用PCR方法和荧光检验可以发现mig2－5－1启动子能诱导EGFP在菌株中获得大量且高效地荧光表达，同时能稳定地遗传表达。本发明提供的增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株，能够用于抗玉米丝黑穗病的玉米品种的筛选与鉴定方面，鉴定结果可靠，操作方便，简单易行，鉴定周期短，不受环境影响，重复性高。

技术领域

本发明涉及植物病理学技术领域，尤其涉及一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法及其菌株和应用。

背景技术

玉米丝黑穗病又称乌米、哑玉米，是我国玉米的主要病害之一。玉米丝黑穗病是在玉米发芽期侵入的侵染性病害，一经感病，首先破坏雌雄穗，使果穗形成一个黑粉包。由于部分品种的抗病性不强或不抗病、病菌变异、防治不力等原因，近年来，发病率有所提高，严重影响玉米产量。

玉米丝黑穗病是由玉米丝轴团散黑粉菌引起的真菌病害。玉米丝黑穗病菌以冬孢子散落在土壤中，混入粪肥里或沾附在种子表面越冬，翌年在玉米发芽时直接侵入玉米幼芽的分生组织的侵染性病害。

对于玉米丝黑穗病的传统的防治方法主要以种子包衣为主，但该方法会造成农民生产成本的提高，并对环境产生不良影响，选育和推广抗病品种是控制玉米丝黑穗病发生的有效措施。而抗玉米丝黑穗病资源鉴定是培育抗病玉米新品种基础，传统资源评价方式为田间菌土接种法，该法存在鉴定周期长、用地量多、鉴定群体大、受环境影响较大等缺点。

寻找简单易行、鉴定周期短、不受外界影响的方法筛选抗玉米丝黑穗病的玉米品种是关键。荧光蛋白基因可以作为报告基因，对细胞内的物质进行跟踪定位。增强型绿色荧光蛋白(EGFP)荧光性稳定、检测方便、无种属特异性、对受体细胞无毒害，因此，可作为一种性能优异的报告基因，广泛应用于分子学生物方面。

有鉴于此，本发明提出增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法及其菌株和应用。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，构建了含mig2－5－1启动子调控EGFP表达的载体PHD3－mig2－5－1－EGFP并转入玉米丝黑穗菌内，使得增强型绿色荧光蛋白在玉米丝黑穗菌株中能够获得大量且高效地荧光表达，且能稳定地遗传的表达。

本发明的第二目的在于提供一种通过上述方法制备的增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株，该菌株能够正常生长且能正常荧光表达，对玉米植株有致病性，能够清晰的观察到玉米丝黑穗菌株在玉米植株内的菌丝状态，便于更加形象地理解病原菌与植物之间的互作关系。

本发明的第三目的在于提供上述增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株在抗玉米丝黑穗病的玉米品种的筛选与鉴定方面的应用，鉴定结果可靠，操作方便，简单易行，鉴定周期短，不受环境影响，重复性高。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种增强型绿色荧光蛋白标记玉米丝黑穗菌株的方法，包括如下步骤：

(a)构建增强型绿色荧光蛋白标记的表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP；

(b)制备玉米丝黑穗菌原生质体；

(c)利用原生质体遗传转化法，将表达载体PHD3－mig2－5－1－EGFP转入玉米丝黑穗菌内；

(d)对标记增强型绿色荧光蛋白的玉米丝黑穗菌株进行检测和筛选；

(e)获得增强型绿色荧光蛋白标记的玉米丝黑穗菌株；