[发明专利]一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的益生重组酿酒酵母

说明书

本发明公开了一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的益生重组酿酒酵母，该重组酿酒酵母中含有辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，该载体中含有特定的蛋白酶基因和抗菌肽基因。本发明基因重组酿酒酵母能够实现蛋白酶降解，增加氮源或生产功能性小肽，同时分泌的抗菌肽具有抑制杂菌，促进机体生长和增强免疫等多种作用。此外，将不同特性的蛋白酶基因间的组合搭配，发挥不同蛋白酶对蛋白质降解的协同作用，其中重组酿酒酵母能够实现分泌不同pH范围的蛋白酶类，并不对抗菌肽基因进行降解，从而同步实现蛋白的降解和抗菌肽分泌等。

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程等领域，更具体地，涉及一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母。

背景技术

饲料原料中蛋白质成分一般比较丰富，一般需要通过蛋白酶类降解成肽类、氨基酸，进行再利用；许多益生菌类，例如芽孢杆菌以及黑曲霉或米曲霉等都会分泌蛋白酶，对环境中蛋白质成分进行分解利用，从而促进益生菌自身的菌体生长，但是酿酒酵母或乳酸菌分泌的蛋白酶类较少，对蛋白质物料降解能力较低，一般需要补充蛋白胨等蛋白质降解代谢物才能较好的生长；饲料中也一般采用酸性或中性蛋白酶。蛋白酶按照其作用方式，分为内切酶和外切酶，一般的微生物蛋白酶类通常分为内切酶和外切酶的混合物。饲用动物大多需要补充蛋白酶类，例如早期断奶仔猪常需要添加蛋白酶类，弥补体内分泌消化酶的不足。

抗菌肽(antimicrobial peptide)原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。抗菌肽抑制致病菌生长，不同抗菌肽对细菌、真菌、原虫以及病毒等具有不同杀伤能力；抗菌肽还具有选择性免疫激活和调节功能。

酿酒酵母作为益生菌的重要组成部分。在酿酒酵母表达系统实现蛋白质降解酶类和抗菌肽的分泌表达，能够将两者的优点进行有机搭配：一方面分泌出来蛋白酶可以降解培养基中的蛋白质，增加氮源、促进目的益生菌生长；另一方面可以分泌抗菌肽，抑制杂菌。此外，表达的蛋白酶基因中，发挥了不同最适pH下的蛋白酶或不同酶切位点的蛋白酶之间的协同作用，因而能够更有效地对蛋白质原料进行降解，生产具有功能性的小肽或氨基酸等。在应用方面，利用酵母培养物饲养动物，能补充消化酶、增强免疫并促进生长；在餐厨废弃物中，降解废弃蛋白质、增加氮源、抑制杂菌。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种能够在饲料添加、工业酒精生产、餐厨废弃物等能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽重组酿酒酵母。本发明是通过将酸性蛋白酶(Acid protease)基因、中性蛋白酶(Neutral protease)基因、天冬氨酸蛋白酶(Aspartic-type Endopeptidase)基因、丝氨酸蛋白酶(Serine Protease)基因不同的搭配和优化，结合抗菌肽基因通过酿酒酵母共表达载体转入到酿酒酵母中。不同的蛋白酶基因基因间的不同搭配，可实现蛋白酶间的合理优化，有效发挥蛋白酶间的协同作用，同时分泌有抗菌活性的抗菌肽类，从而得到具有多功能益生重组酿酒酵母。

本发明的目的在于提供一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体及其构建方法。

本发明的另一目的在于提供一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的益生重组酿酒酵母及其构建方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，该载体中含有蛋白酶基因、抗菌肽基因；

所述抗菌肽基因的碱基序列如SEQ ID NO：5所示；

所述蛋白酶基因选自酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、天冬氨酸蛋白酶基因、丝氨酸蛋白酶基因中的至少一种。