[发明专利]黄野螟过氧化氢酶全长序列及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及到黄野螟过氧化氢酶基因全序列及其克隆方法。该基因编码过氧化氢酶，该酶(CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的抗氧化酶，是生物建立防御系统的关键酶之一，其生物学功能是催化细胞内过氧化氢的分解，具有重要的生物化学研究价值。

技术背景

过氧化氢酶(Catalase，CAT)与超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD) 和过氧化物酶(Peroxidase，POD)共同组成生物体抗氧化酶体系，清除细胞内的自由基。其中过氧化氢酶，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除生物体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。 CAT作用于过氧化氢的机理实质上是H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。H2O2浓度越高，分解速度越快。对该基因的研究为可以作为靶标设计新型氧化酶抑制剂提供了基础。

黄野螟(Heortia vitessoides)属鳞翅目(Lepidoptera)，螟蛾科(Pyralidae)，在我国广泛分布于广东、广西、海南和云南等南方各省以及香港特别行政区。黄野螟是典型的寡食性害虫，仅取食沉香属(Aquilaria)和漆树属(Rhus)等少数几种植物近年来，随着海南、广东和云南等地人工大规模种植白木香面积的日益扩大，黄野螟的危害也越来越严重。据广东化州地区统计，黄野螟发生严重时，白木香的被害株率可高达90％以上。有关黄野螟过氧化氢酶基因目前无人研究，本发明填补了这一空白，对深入研究黄野螟体内保护酶系活性与杀虫剂、昆虫病毒、微孢子虫等外界刺激强度相互作用关系以及昆虫耐药性和抗逆性提供基础。

发明内容

本发明的目的在于提供黄野螟过氧化氢酶基因全序列及其克隆方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

1、黄野螟总RNA的提取

将外地采集的黄野螟活成虫经清洗、消毒、麻醉、液氮冷冻后保存在无菌去酶的 EP管中，并置于-70℃低温冰箱内保存备用。采用E.Z.N.A.^TMTotal RNA Kit II总RNA提取试剂盒(OMEGA)来提取黄野螟的总RNA。

2、引物设计和3′RACE扩增

在本实验室构建的cDNA文库中，查找并获得了黄野螟过氧化氢酶基因的5′端序列，本发明是在此基础之上进行3′RACE扩增，目的在于获得黄野螟过氧化氢酶基因全序列。

3′RACE扩增的特异性引物为：

HV-CAT-3′-Outer：AAAAACGGGAGCACCAGT；

HV-CAT-3′-Inner：CGCTGATGCCAAGAAACG。

3、目的基因克隆及测序

获得的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收相应目的DNA片段，同pMD20-T 载体进行连接，将连接后的产物转化到E.coli DH5α感受态细胞之中，然后进行AMP抗性蓝白斑的筛选，挑取合适的阳性菌落进行质粒提取。最后经由菌落PCR鉴定后进行测序。

4、序列拼接

将测序正确的序列与实验室已构建的黄野螟cDNA文库中的过氧化氢酶基因序列进行不重复拼接，从而获得黄野螟过氧化氢酶基因全长序列。

黄野螟过氧化氢酶基因全长序列，此序列如下：

此序列中划线处标示的atg为初始密码子，划线处标示的taa为终止密码子。

根据黄野螟过氧化氢酶酶基因ORF(Open reading frame)全序列，得到其氨基酸序列。该序列如下：

本发明获得了黄野螟过氧化氢酶基因全序列，通过对黄野螟成虫的预处理、总RNA 的提取、3′RACE扩增、目的基因片段的克隆及其序列的拼接，得到了黄野螟过氧化氢基因全长序列，该序列全长2039bp，ORF序列全长1524bp，共编码507个氨基酸。

具体实施方式

以下实施例将本发明进一步说明。

1、黄野螟总RNA提取