[发明专利]表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统及其应用

说明书

本发明公开了一种表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统及其应用。本发明所述的表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统包括西尼罗病毒限制性复制子质粒以及稳定表达西尼罗病毒C‑prM‑E蛋白的重组细胞系。使用本发明的系统获得的限制性复制西尼罗病毒(△WNV)，该病毒在BWNV‑CME细胞系中具有与WNV全病毒相似的特性，且可以表达GFP，具有可视化效果，更重要的是，该病毒只能在本系统内进行复制，感染其他细胞时则不能产生仔代病毒，因此具有极高的安全性，可用于WNV中和抗体检测以及抗病毒药物筛选。本发明的提出提高了WNV相关操作的安全性与简便性，不依赖于BSL‑3高等级生物安全条件，为WNV疫苗评价、抗病毒药物筛选及病毒致病机制研究提供了良好的技术手段。

技术领域

本发明涉及一种病毒复制系统及其应用，特别涉及一种表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统及其应用，本发明属于生物技术领域。

背景技术

西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)属黄病毒科，黄病毒属，是一种重要的人兽共患传染病病毒，能引起人严重的神经系统疾病。WNV病毒颗粒直径约40nm～60nm，有囊膜，膜内的病毒核衣壳呈二十面体对称，直径约30nm。WNV基因组为一条单链正义RNA，长约11kb。基因组由5’端长96nt和3’端长337-649nt的非编码区(UTR)及一个长约10.3kb的单一开放阅读框(open reading frame,ORF)构成。ORF从5’端97位起始，至3’端10398位终止，编码1个全长为3433个氨基酸的多聚蛋白前体，经宿主和病毒蛋白酶的切割加工后产生3种结构蛋白：C蛋白(衣壳/核心蛋白)、prM/M(膜前体蛋白/膜蛋白)和E蛋白(囊膜糖蛋白)以及7种非结构蛋白。

西尼罗病毒病是由西尼罗病毒引起的传染病，是一种人兽共患病。该病对我国来说是外来病，目前在中国内地还未见报道，但中国的气候、地理环境复杂，蚊虫种类繁多，具备传播条件，且俄罗斯、印度等周边国家已有该病的流行，随着国际交流的日益频繁，WNV传入中国境内的可能性不容忽视，如近年来已经从新疆的蚊中分离出了WNV的报道。所以对我国而言，WNV流行爆发的风险非常大，且目前还没有疫苗或有效的药物来预防和治疗感染西尼罗河病毒，所以有必要研究相应预防控制措施。但WNV是人兽共患性病原，疫苗等相关研究的活病毒操作需要在高等级生物安全实验室进行，这在一定程度上阻碍了相关疫苗与药物研究。

为了促进WNV疫苗研制以及筛选新抗病毒药物，本发明构建了缺失全部结构蛋白的全病毒基因组，并在其结构蛋白区域插入GFP报告基因的WNV复制子质粒pWNVrepGFP-dCME，以及构建了稳定表达C-prM-E蛋白的细胞系；复制子质粒、重组细胞系与包装的△WNV病毒构成了一个限制性复制的西尼罗病毒系统。本发明的复制缺陷型西尼罗病毒系统可为西尼罗病毒的流行病学调查、疫苗评价、抗病毒药物筛选和西尼罗河病毒复制和发病机理的研究提供安全、简便的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种表达绿色荧光蛋白且只能在系统内具有感染性与复制能力的西尼罗病毒(WNV)制备系统，以应用于安全、可视化的、类似于全病毒感染与复制的WNV中和抗体检测系统及药物筛选方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统，包括：

(1)西尼罗病毒限制性复制子质粒：

所述的西尼罗病毒限制性复制子质粒是通过将西尼罗病毒基因组克隆到真核表达载体的启动子下游，并同时将基因组中的结构蛋白C-prM-E序列替换为绿色荧光蛋白基因后得到的；

(2)稳定表达西尼罗病毒C-prM-E蛋白的重组细胞系

所述的重组细胞系是通过将含有西尼罗病毒C-prM-E蛋白表达基因的真核表达载体转染哺乳动物细胞后得到的。