[发明专利]表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统及其应用

权利要求书

1.一种表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统，其特征在于包括：

（1）西尼罗病毒限制性复制子质粒：

所述的西尼罗病毒限制性复制子质粒是通过将西尼罗病毒基因组克隆到真核表达载体pCI-neo的启动子下游，并同时将基因组中的结构蛋白C-prM-E序列替换为绿色荧光蛋白基因后得到的；所述的西尼罗病毒限制性复制子质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）稳定表达西尼罗病毒 C-prM-E蛋白的重组细胞系

所述的稳定表达西尼罗病毒 C-prM-E蛋白的重组细胞系是通过以下方法构建得到的：

1）人工合成优化后的C-prM-E蛋白表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，优化后的序列命名为opti-WNV-CME，进行人工合成后通过PCR方法扩增优化后的序列，并在PCR产物的5′端引入 SacⅠ酶切位点，3′端引入 XhoⅠ酶切位点，双酶切后的PCR 产物与同样双酶切的 pCAG-neo载体相连，连接产物转化DH5α后，挑选重组克隆、经酶切和测序鉴定，获得阳性克隆后用试剂盒大量制备质粒，命名为pCAG-WNV-CME，用SspI进行线性化后冻存于-20℃备用；

2）选生长状态良好的BHK-21细胞消化传代至 24 孔板中，待 BHK-21细胞长至 90%满时，用线性化后的重组质粒pCAG-WNV-CME转染细胞，获得稳定表达的稳定表达西尼罗病毒C-prM-E蛋白的重组细胞系，命名为BWNV-CME。

2.权利要求1所述的系统在获得表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒中的用途。

3.一种获得表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

以含有 10%（v/v） FBS 的DMEM 培养基为生长培养基，1：4传代培养权利要求1所述的稳定表达西尼罗病毒 C-prM-E蛋白的重组细胞系，将对数生长期的重组细胞以5 ×10⁵ /ml 接种 6孔细胞培养板，过夜培养，将权利要求1所述的西尼罗病毒限制性复制子质粒加入 Opti-MEM 中制成 DNA 稀释液，每3 μg 质粒加入200 μl opti-MEM，加入 20 μl X-treme HP 转染试剂，室温静置15min，将 DNA 转染试剂复合物逐滴加入含有稳定表达西尼罗病毒 C-prM-E蛋白的重组细胞的培养液中，72 h 后观察荧光，收取上清，离心过滤后储存于 －80℃备用。

4.按照权利要求3所述的方法获得的表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒。

5.权利要求4所述的表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒在制备西尼罗病毒中和抗体检测试剂以及筛选抗西尼罗病毒药物中的用途。