[发明专利]用于序列操纵的Argonaute‑核酸序列组分系统、方法以及组合物

说明书

技术领域

本发明涉及用于序列操纵的Argonaute-核酸序列组分系统、方法以及组合物。具体而言，本发明涉及能在核酸链帮助下切割靶核苷酸序列的Argonaute、Argonaute-核酸序列组分组合物、Argonaute-核酸序列组分序列操纵系统，及利用所述Argonaute、Argonaute-核酸序列组分组合物和Argonaute-核酸序列组分序列操纵系统操纵序列的方法。

背景技术

Argonaute家族蛋白(Ago)广泛存在于动植物、细菌和古生菌中。动植物细胞中的Argonaute(eAgo)蛋白通过单链RNA介导的RNAi的机制调控细胞内mRNA的降解和翻译，以达到基因表达调控的目的。近些年的研究表明，细菌和古生菌中的Argonaute蛋白承担着相似于eAgo的功能：它们通过DNA或者RNA介导来抵御外来核酸的入侵。至今已有多个细菌或者古生菌已报道具有核酸酶活性，能够切割DNA。在细菌中，已有AaAgo(Yuan Y.R.,Pei Y.,Ma J.B.,Kuryavyi V.,Zhadina M.,Meister G.,Chen H.Y.,Dauter Z.,Tuschl T.,Patel D.J.Crystal structure of Aaeolicus Argonaute,a site-specific DNA-guided endoribonuclease,provides insights into RISC-mediated mRNA cleavage.Mol.Cell 2005；19:405-419.)、RsAgo(Olovnikov,I.,Chan,K.,Sachidanandam,R.,Newman,D.K.and Aravin,A.A.Bacterial argonaute samples the transcriptome to identify foreign DNA.Mol.Cell,2013 51,594–605.)和TtAgo(Swarts D.C.,Jore M.M.,Westra E.R.,Zhu Y.,Janssen J.H.,Snijders A.P.,Wang Y.,Patel D.J.,Berenguer J.,Brouns S.J.,et al.DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute.Nature2014；507:258-261.)蛋白有核酸酶活性；在古生菌中，已有MjAgo(Zander A.,Holzmeister P.,Klose D.,Tinnefeld P.,Grohmann D.Single-molecule FRET supports the two-state model of Argonaute action.RNA Biol.2014；11:45-56.)和PfAgo(Swarts D.C.,Hegge J.W.,Hinojo I.,Shiimori M.,Ellis M.A.,Dumrongkulraksa J.,Terns R.M.,Terns M.P.,and Oost J,Argonaute of the archaeon Pyrococcus furiosus is a DNA-guided nuclease that targets cognate DNA.Nucleic Acids Res.2015 43(10):5120-9.)。

最近发现的两个有活性的Argonaute蛋白：TtAgo和PfAgo，都是来源于高温生长环境下的微生物。详尽的生化实验表明TtAgo和PfAgo都需要长度约20nt的5’端磷酸化的单链DNA来介导切割靶点单链DNA。当用两条完全互补的5’端磷酸化的单链DNA介导，则可以使带有对应靶点的质粒线性化。但是酶切反应所需的温度都在75℃，明显高于大多数生物的生存温度。需要进行高温酶切也极大限制了这两个酶在动植物细胞中进行基因编辑的应用。因此，寻找一个能在常温下发挥作用的Argonaute蛋白，对于应用于动植物细胞的基因编辑显得尤为重要。