[发明专利]一种表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株及其制备方法

说明书

本发明公开了一种制备表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株的方法，步骤如下：(1)制备中国被毛孢Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液；(2)制备含有重组质粒pRF‑AETH的根癌农杆菌；(3)制备根癌农杆菌菌液；(4)将中国被毛孢Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液与根癌农杆菌菌液混合，共培养；(5)选择性培养，鉴定，获得稳定表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis。本发明还提供了一种中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株。本发明方法可以获得稳定表达egfp基因的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株。该转化菌株不仅可以为中国被毛孢Hirsutella sinensis功能基因的分子生物学研究提供方便，而且可以监测中国被毛孢Hirsutella sinensis在寄主昆虫体内的生长与繁殖、发育与分化的过程,为阐明中国被毛孢Hirsutella sinensis与寄主的相互作用提供直接证据，应用前景优良。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株及其制备方法。

背景技术

冬虫夏草是一种在特定生态环境下,由虫生真菌-中国被毛孢Hirsutellasinensis寄生于鳞翅目蝙蝠蛾幼虫所形成的具有很好保健与药用功效的复合物(Zhang YJ et al.,2012；Paterson R R.,2008)。因其具有奇特的保健与药用功效,市场需求激增,自然资源采集疯狂,致使资源已濒临枯竭。因此，人工培养冬虫夏草已成为人们寻求补充野生冬虫夏草渐逐断源的重要途径(Holliday J et al.,2008)。但是，由于真菌进入蝙蝠蛾幼虫体内最后形成冬虫夏草的机制目前尚不清楚，导致人工培养难度大。

因此，研究中国被毛孢Hirsutella sinensis在蝠蛾体内生长与繁殖、发育与分化过程极为重要，不仅具有重要的理论意义,而且更具有实际应用价值，这将为人工培育冬虫夏草提供重要的科学依据。

eGFP是一种增强型绿色荧光蛋白，这种蛋白分子量小、在生物体内可以表达稳定、而且无毒、通常不影响生物自身的生长与繁殖、发育与分化，它可以作为生物标记，用于研究目标生物体的生长发育状况。如果能够制备得到表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis，将会使得中国被毛孢Hirsutella sinensis在蝠蛾体内生长与繁殖、发育与分化过程的研究极为方便、有效。

但是，中国被毛孢Hirsutella sinensis是一种很特别的虫生真菌，迄今为止，尚未见含EGFP荧光标记的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化子。

因此，建立高效中国被毛孢Hirsutella sinensis遗传转化方法，获得稳定表达绿色荧光蛋白的标记菌株,对于推动中国被毛孢Hirsutella sinensis侵染过程的生物学研究及其分子生物学研究具有重要的应用价值，也可以为冬虫夏草的人工栽培提供科学依据。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供了一种制备表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株的方法以及该方法制备得到的转化菌株。

本发明制备表达绿色荧光蛋白中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株的方法，步骤如下：

(1)制备中国被毛孢Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液；

(2)制备根癌农杆菌感受态，转化重组质粒pRF-AETH，获得含有重组质粒pRF-AETH的根癌农杆菌；

(3)取含有重组质粒pRF-AETH的根癌农杆菌，制备根癌农杆菌菌液；