[发明专利]一种表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株及其制备方法

权利要求书

1. 一种制备表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢 Hirsutella sinensis转化菌株的方法，其特征在于：步骤如下：

（1）制备中国被毛孢 Hirsutella sinensis芽生孢子的悬浮液；

（2）制备根癌农杆菌感受态，转化重组质粒pRF-AETH，获得含有重组质粒pRF-AETH的根癌农杆菌；其中，重组质粒pRF-AETH是将质粒pRFHUE-eGFP中的启动子pGpdA替换为虫生真菌启动子pAT、并将启动子Trpc替换为虫生真菌启动子pTrpc得到的质粒，虫生真菌启动子pAT、pTrpc的序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

（3）取步骤（2）制得的含有重组质粒pRF-AETH的根癌农杆菌，制备根癌农杆菌菌液；

（4）将步骤（1）制备的中国被毛孢 Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液与步骤（3）制备的根癌农杆菌菌液混合，共培养；

（5）选择性培养，鉴定，获得表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢 Hirsutella sinensis。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的中国被毛孢Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液中孢子的浓度为10⁴ ~ 10⁵个/mL。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述含有重组质粒pRF-AETH的根癌农杆菌是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC NO：M 2016223的根癌农杆菌AGL-1/pRF-AETH。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，制备得到的根癌农杆菌菌液的OD₆₀₀为0.6 ~ 0.7。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，中国被毛孢 Hirsutella sinensis芽生孢子悬浮液与步骤（3）制备的根癌农杆菌菌液混合后，共培养的方法是：将混合后的菌液涂布到共培养平板上培养，其中，共培养平板为铺有微孔滤膜的IM培养基，共培养条件为15~20℃避光培养2~4 d。

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的根癌农杆菌菌液或IM共培养的平板中含有乙酰丁香酮，所述乙酰丁香酮的终浓度为200~400 µM。

7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，选择性培养是将步骤（4）共培养后的微孔滤膜取下，反向铺到含抗生素的PDA培养基中，15~18 ℃培养3~4周。

8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的抗生素是终浓度为200 ~ 350 µg/mL的头孢霉素和终浓度为200 ~ 250 µg/mL的潮霉素B。

9. 权利要求1~8任意一项所述方法制备得到的表达绿色荧光蛋白的中国被毛孢Hirsutella sinensis转化菌株。

10. 一种中国被毛孢 Hirsutella sinensis转化菌株，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC NO：M 2016222的中国被毛孢H.sinensis AETH-T55。