[发明专利]IFITM3蛋白装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株感染药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，更具体地，涉及IFITM3蛋白装载的外泌体在制备抗登革病毒干扰素拮抗株（DENV-2 NGC）感染药物中的应用。

背景技术

登革病毒（dengue virus, DENV）属于黄病毒科黄病毒属中的一个病毒种，根据抗原表位的不同分为1，2，3，4四种血清型（DENV1~4）。登革病毒主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）等昆虫媒介传播，引起登革热（dengue fever, DF），以及病死率较高的登革出血热（dengue hemorrhagic fever, DHF）和登革休克综合征（dengue shock syndrome, DSS）。目前，登革热被列为全球最重要的蚊虫传播性疾病，已成为一个严重的全球性公共卫生问题。尽管如此，目前国内外尚无有效的预防性疫苗，也无针对病毒的特效性治疗药物。

干扰素（interferon, IFN），是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的。IFN是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制，同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。是目前最主要的抗病毒感染的生物制品。2008年，研究人员发现一株2型登革病毒株DENV2 New Guinea C (NGC) (GenBank accession number M29095)可以抑制宿主细胞的干扰素免疫应答，并最终确定这种抑制效应是毒株特异性而非血清型特异性。该株登革病毒拮抗干扰素的机制目前正研究中：（1）其中很重要的一个方面是，登革病毒具有拮抗IFN-I产生的能力。据报道，登革病毒NS2B/3蛋白酶通过靶向人细胞的MITA/STING蛋白，干扰RIG-I和MDA5的信号传递，抑制宿主细胞IFN-I的产生。（2）另外研究发现，登革病毒NS5与STAT2相结合，NS5蛋白通过蛋白酶体介导STAT2的降解而抑制IFN-I下游信号途径。目前国内外尚未有针对干扰素拮抗病毒株感染的特异性有效治疗药物。

1984年，Friedman等人在经IFN处理的神经细胞瘤细胞进行cDNA筛查时首次发现干扰素诱导跨膜蛋白家族（interferon-inducible transmembrane proteins, IFITM），位于11号染色体上。人类该基因具有ifitm1、ifitm2、ifitm3、ifitm5四种类型，表达的蛋白为14-17 kD的跨膜蛋白。2009年Brass等]研究者基于大规模RNA干扰技术的基因组功能筛查，发现IFITM家族蛋白作为一种干扰素诱导的抗病毒蛋白，能较强的抑制流感病毒和黄病毒的对宿主细胞穿入过程，进而发挥高效的抗流感病毒活性。接着，相继揭示了IFITM蛋白具有广谱的抗病毒活性。但是，IFITM蛋白在宿主细胞中参与抑制病毒穿入的具体分子机制，以及该蛋白参与宿主的抗病毒天然免疫的作用方式尚未明确还有待深入研究。

外泌体（exosome）又称胞外体，是由细胞内的多泡体（multivesicularbody, MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种膜性囊泡，大小为40～100 nm大小。目前研究发现在病毒感染时，宿主细胞会将干扰素诱导的抗病毒蛋白包装成外泌体形式，进行抗病毒蛋白的细胞间传递，使宿主形成更强的抗病毒免疫状态。2013年，袁正宏教授的研究团队发现包装了抗病毒分子的外泌体可直接在肝细胞间传递，进而增强了IFN-α诱导的抗病毒免疫应答。外泌体传递宿主细胞抗病毒蛋白，为新型抗病毒药物的开发开拓了新的方向。本研究通过探索包装抗病毒蛋白的外泌体，是否可以特异性地作用于干扰素拮抗的登革病毒株（DENV-2 NGC），如此可对未来的病毒性病原体所致的疾病的防治提供新的线索与思路。

发明内容

本发明人通过研究发现，通过本发明提供的IFITM3蛋白装载的外泌体能够特异性抗登革病毒干扰素拮抗株（DENV-2 NGC），其作用机制为高表达IFITM3蛋白的外泌体能够特异性地抑制登革病毒干扰素拮抗株（DENV-2 NGC）穿过宿主细胞膜进入宿主细胞的过程。这就为新型抗干扰素拮抗株病毒药物的开发和机体天然免疫机制的研究开拓了新的方向。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

1. 构建高表达IFITM3重组质粒，制备方法为：