[发明专利]一种提取草莓RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，尤其涉及一种提取草莓RNA的方法。

背景技术

RNA的提取是分子生物学的基本技术之一，高质量的RNA是进行基因克隆、基因表达研究等的前提。但由于RNA很容易被RNase降解，而且RNase广泛存在而且不易变性失活。因此，高质量RNA的分离已经成为分子生物学实验关键的技术之一。

草莓的叶片、果实、花等部位均含丰富的酚类物质、多糖等多种次生代谢物，在提取RNA的过程中难以完全去除，会干扰RNA的分离。因此，能否在提取过程中尽量去除这些干扰物质是获得高质量RNA的关键。目前提取RNA的主要方法有酸酚法、CTAB法、热酚法、冷酚法、SDS酸酚法、异硫氢酸胍法和Trizol法等。这些方法都能提取到草莓的RNA，提取效果不太理想，特别是对于老的叶片和成熟的果实。因此，发展一种适用于草莓RNA提取的高质量方法对于提高实验效率非常必要。

发明内容

本发明针对现有中的缺点，公开了一种提取草莓RNA的方法，解决了草莓次生物含量高导致的高质量RNA提取困难的问题，本发明对常用的CTAB-LiCl方法加以改良，同时加入对核糖核酸酶有抑制作用的SDS，获得了一种草莓RNA提取的有效方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决。

一种提取草莓RNA的方法，包括以下步骤，

(1)将裂解液预热到55～65℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入5～10ml预热后的裂解液，在55～65℃下保温1～5分钟，其间晃动1～2次使其混合，得到混合物Ⅰ；本发明在传统CTAB-LiCl提取的方法上进行了改良，在裂解液中加入了SDS，不仅增加了核酸的裂解效率，还能使蛋白质变性、去除多糖，对Rnase有较强的抑制作用，避免了高温可能导致的RNA降解。

(2)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与裂解液等体积；混合后在15℃以上离心，收集上清液；

(3)再加入8-14M LiCl和无水乙醇，其中，加入LiCl的体积是上清液的1/6-1/3，加入无水乙醇的体积是上清液的1/10-4/10；在1～4℃放置1h～12h，2-5℃离心后，收集沉淀；用沉淀液沉淀裂解样品；在LiCl中加入了适量的无水乙醇，增加了RNA的沉淀效率，一定程度上增加了RNA得率。

(4)将溶解液预热到55-70℃，用预热后的溶解液溶解沉淀；

(5)向步骤(4)得到的含沉淀的溶解液中加入与含沉淀的溶解液等体积的氯仿/异戊醇混合液，2-5℃离心分离得到上清液；用氯仿/异戊醇混合液纯化含沉淀的溶解液。

(6)向步骤(5)得到的上清液中加入乙醇，加入乙醇的体积为步骤(5)得到的上清液的2～3倍，-15至-25℃放置30min以上，2-5℃离心，收集沉淀；用乙醇沉淀纯化过的溶解液。

(7)步骤(6)所得的沉淀物中加入含有75-85％乙醇的DEPC水，加入含有75-85％乙醇的DEPC水的体积为步骤(5)加入乙醇体积的0.5-1.5倍，2-5℃离心收集沉淀物；

(8)将步骤(7)所得的沉淀物放在无菌工作台上吹干，吹干后加入DEPC水使沉淀物溶解，所得混合物为草莓RNA；

其中，步骤(1)中，裂解液包括1-5％(m/V)的CTAB和1-5％的SDS。

作为优选，步骤(1)中，裂解液用0.1-0.5％的DEPC水配置，裂解液包括1-5％(m/V)的CTAB，1-5％的SDS，1-5％的PVP-K30，80-120mM的Tris·Cl，20-30mM的EDTA，1-5M的NaCl，0.01-0.08％的亚精胺；裂解液的pH值控制在7.5-8.5。

作为优选，将裂解液在110-125℃灭菌20-40min，使用时在每100ml裂解液中加入1-3ml的β-巯基乙醇。

作为优选，步骤(1)中，裂解液用0.1％的DEPC水配置，裂解液包括2％(m/V)的CTAB，2％的SDS，2％的PVP-K30，100mM的Tris·Cl，25mM的EDTA，2M的NaCl，0.05％的亚精胺；裂解液的pH值控制在7。

作为优选，步骤(4)中，溶解液包括0.5-2M的NaCl，体积百分比为0.2-1％的SDS，8-15mM的Tris，0.5-2mM的EDTA；且溶解液的pH值为7.5-8.5。

作为优选，步骤(6)中加入的乙醇为无水乙醇。

作为优选，氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。