[发明专利]条件型伊维菌素受体IVMR转基因小鼠模型的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及条件型转基因动物模型的构建方法及应用，尤其是涉及一种条件型伊维菌素受体IVMR转基因小鼠模型的构建方法及在神经元功能研究中的应用。 

背景技术

神经科学研究领域中的一个关键问题就是特定神经元的活性(兴奋性)与行为的因果关系。对这个问题，目前国际上已经发展出了不少新的方法，比如，突触传递的分子操作方法、光遗传学方法和配体门控的离子通道方法。特别是已发展出用配体门控的离子通道用于可诱导和可逆转的调控神经元活性的方法。比如，果蝇Allatostatin受体在被Allatostatin激活的情况下，可以抑制神经元的动作电位的产生，这种方法已经在哺乳动物脑中开始使用。然而，Allatostatin这个分子不能透过血脑屏障，必须通过侵入性的方法(比如脑部打孔埋管)将其注射到脑中，这在进行大规模动物行为实验时就显得很不方便。最近，一种工程化的GABA_A受体已经用来沉默特定的脑神经元，特点是对药物唑吡坦(zolpidem)不敏感。但是这个系统也有明显的缺陷，就是必须在已经表达GABA_Aγ2亚基的神经元中起作用。第三种能够降低神经元发放动作电位的系统就是伊维菌素IVM门控的氯离子通道(该通道来源于线虫谷氨酸氯离子通道GluClα和β亚基)，已有报道显示这种通道在小鼠脑中可以很好的起作用(Lerchner，W.et al.2007.Reversible silencing of neuronal excitability in behaving mice by a genetically targeted，ivermectin-gated Cl-channel.Neuron 54，35-49.)。但是，该系统的一个大的限制就是需要同时表达α和β两个亚基。为了克服这个问题，Lynagh等人将人源的甘氨酸α1受体进行了F207A和A288G两个点突变，使该受体不再对甘氨酸敏感，而对伊维菌素IVM敏感(这个突变后的人甘氨酸α1受体被命名为伊维菌素受体IVMR)，这就提供了一种很好的可诱导和可逆转沉默神经元的工具(Lynagh，T.&Lynch，J.W.2010.An Improved Ivermectin-activated Chloride Channel Receptor for Inhibiting Electrical Activity in  Defined Neuronal Populations.J Bio Chem 285，14890-14897)。但截至目前，国际上只有构建表达伊维菌素受体IVMR受体的病毒进行研究的报道，而将其制备为转基因小鼠模型还未见报道。 

发明内容

本发明的目的就是为了针对现有缺乏伊维菌素受体IVMR转基因小鼠的不足，而提供一种能够更好的用于神经元的活性对动物行为的影响的研究的条件型(或称诱导型)伊维菌素受体IVMR转基因小鼠模型及其构建方法和应用。 

将IVMR的序列整体插入到Rosa26基因位点的下游(该基因为一个表达广泛并且水平很强的基因)，紧接在一个loxP位点包围的STOP元件后面。接着将这样的质粒电转进小鼠胚胎干细胞中进行同源重组，正负筛选、多次PCR进行筛选完成同源重组的胚胎干细胞。再将阳性的胚胎干细胞移植进母鼠的囊胚中，选取出生后嵌合水平最高的嵌合小鼠与野生型小鼠进行交配，鉴定为阳性的子代小鼠即为IVMR转基因小鼠。该小鼠可与Cre重组酶小鼠进行交配或者在脑立体定位注入Cre表达病毒，这样在特定的Cre重组酶的作用下，IVMR前面的STOP序列被剪切掉，IVMR得以在特定神经元中表达出来。在Cre表达的IVMR转基因小鼠腹腔给药IVM即可激活IVMR，降低神经元的活性。 

因此，本发明的一个目的是提供一种条件型表达伊维菌素受体IVMR的转基因小鼠的模型。 

本发明的另一个目的是提供一种构建条件型表达伊维菌素受体IVMR的转基因小鼠模型的方法，该方法包括以下步骤： 

(1)将IVMR-2A-GFP的序列插入到Rosa26基因位点的下游，紧接在一个loxP位点包围的STOP元件后面，构建Rosa26-IVMR打靶载体； 

(2)将Rosa26-IVMR打靶载体电转进小鼠胚胎干细胞中进行同源重组，经过正负筛选和PCR筛选完成同源重组的胚胎干细胞； 

(3)将阳性的胚胎干细胞移植进母鼠的囊胚中，选取出生的嵌合小鼠与野生型小鼠进行交配，鉴定为阳性的子代小鼠即为IVMR转基因小鼠；