[发明专利]一种光学纯R-乙偶姻的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种光学纯R-乙偶姻的生产方法，具体是将(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因(bdh)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh)在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮和葡萄糖为底物高效生产光学纯R-乙偶姻的方法。

背景技术

乙偶姻(acetoin)，即3-羟基-2-丁酮(3-hydroxy-2-butanone)，有两种旋光异构体(R-乙偶姻和S-乙偶姻)，天然地存在于乳品、黄油、干酪、酒类、玉米、葡萄、苹果、草莓、可可等各类食品中，国家标准GB2760-86规定其为允许添加食用的食品香料。乙偶姻应用广泛，其具有明显的奶酪香、脂香特征，主要用于奶油、乳品、咖啡、酸奶等香料的生产。此外，乙偶姻是一种重要的化学合成中间体和多功能材料，2004年美国能源部将乙偶姻列为30种优先开发利用的平台化合物之一，可广泛应用于食品、制药、化工等领域。例如，80％含量的乙偶姻俗称“醋嗡”，是酒类调香中一个极其重要的品种。含有乙偶姻和丁二酮的混合物还可以用来治疗乳腺炎。在制药工业中，光学纯乙偶姻作为具有立体结构专一的化合物可以用来合成合成具有光学活性的手性药物，从而较大程度地提高药效，减轻药物的副作用。此外，光学纯乙偶姻还可用于合成手性液晶复合材料。

光学纯乙偶姻的生产方法主要分为两类：化学合成法与生物合成法。化学合成的原料来源于不可再生的化石资源——石油，原料来源受到限制，且合成过程繁琐，最后还需要通过化学法进行复杂的手性拆分，存在成本高、收率低、光学纯度低、高能耗、高污染的问题，因此难以实现低成本大规模生产。生物合成方法生产乙偶姻具有诸多优点，如产品绿色天然、反应条件温和、污染少、能耗低，是一种十分具有发展前景的环境友好合成方法，近年来受到了越来越多的关注。然而，天然微生物发酵产生的一般都是R-乙偶姻和S-乙偶姻的旋光异构体混合物，发酵产物手性拆分工艺繁琐，成本高昂。1984年，Ui等报道了利用Pseudomonas sp.S-4发酵法合成单一构型R-乙偶姻【J.Ferment.Technol.,1984,62:151-156】。该法存在产物浓度低(1.72g/L)和发酵周期长(48h)的问题。中国专利申请号CN201310346916.8于2013年公开了郝健等利用一株克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)突变菌株发酵生产R-乙偶姻，最高产量为35.7g/L。然而，K.pneumoniae被世界卫生组织列为致病菌株(Risk group2，pathogenic microorganisms)，大规模工业化生产的安全性原则在很大程度上限制了其应用【Biotechnol.Adv.,2009,27:715-725；Appl.Environ.Microbiol.,2011,77:5467-5475；Bioresour.Technol.,2012,124:237-244】。

鉴于此，人们尝试构建大肠杆菌基因工程菌株来合成R-乙偶姻。1998年，Ui等将K.pneumoniae编码α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶和meso-2,3-丁二醇脱氢酶的基因簇整合到大肠杆菌中，然后将meso-2,3-丁二醇脱氢酶的编码基因敲除，获得的重组大肠杆菌可以发酵葡萄糖产生17.5g/L光学纯R-乙偶姻【Lett.Appl.Microbiol.,1998,26:275-278】，但发酵法由于发酵液成分复杂，导致发酵产物分离提取困难。此外，该法还存在发酵周期长和底物转化率低的问题，限制了其产业化应用。