[发明专利]一种光学纯R-乙偶姻的生产方法

权利要求书

1.(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种光学纯R-乙偶姻的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh以及葡萄糖脱氢酶基因gdh在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮为前体转化生产光学纯R-乙偶姻。

3.如权利要求2所述生产光学纯R-乙偶姻的方法，其特征在于，所述以重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂，以丁二酮为前体转化生产光学纯R-乙偶姻的方法，包括如下步骤：

(1)平板培养：将重组大肠杆菌划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养；

(2)种子培养：在无菌的条件下，用牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到10～100mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养；

(3)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(2)所得的菌液以体积比为1～10％的接种量接种到0.5～10L的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养2～10小时，然后再加入终浓度为0.1～3mM的IPTG，10～37℃诱导2～20小时，得到一种培养物；

其中，上述步骤(1)～(3)中所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，121℃条件下灭菌15分钟；

(4)收集菌体：将步骤(3)培养得到的培养物5,000～8,000rpm离心5～15分钟；并用生理盐水洗涤菌体2～3遍，然后将细胞悬浮于pH6～8的缓冲液中，使细胞干重的终浓度为2～20g/L，即得到重组大肠杆菌休止细胞生物催化剂，置于4℃的冰箱中待用；

(5)转化反应制备光学纯R-乙偶姻：以细胞干重浓度为2～20g/L的生物催化剂，在10～42℃、pH5～9条件下，50～200rpm震荡条件下对底物进行转化，转化初始浓度为5～25g/L的丁二酮，并加入10～100g/L的葡萄糖以补充反应所需辅酶因子的消耗；间隔补加丁二酮和葡萄糖，使反应体系中的丁二酮浓度维持在5～25g/L之间，葡萄糖浓度维持在5～50g/L之间，当R-乙偶姻的浓度不再增加时，停止转化。

4.如权利要求3所述生产光学纯R-乙偶姻的方法，其特征在于，步骤(3)所述诱导温度优选10～30℃；诱导时间优选10～20小时。

5.如权利要求3所述生产光学纯R-乙偶姻的方法，其特征在于，步骤(5)所述转化反应优选细胞干重浓度为5～20g/L，在20～37℃，pH6～9条件下对丁二酮进行转化。

6.如权利要求3所述生产光学纯R-乙偶姻的方法，其特征在于，步骤(5)所述初始丁二酮浓度优选10～20g/L，初始葡萄糖浓度优选20～50g/L。

7.如权利要求3所述生产光学纯R-乙偶姻的方法，其特征在于，步骤(5)所述转化反应过程中补加丁二酮和葡萄糖，丁二酮浓度优选维持在10～20g/L，葡萄糖浓度优选维持在10～50g/L。

8.(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因bdh在光学纯R-乙偶姻生产方面的应用。