[发明专利]精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及方法

说明书

本申请要求于2012年08月17日提交中国专利局、申请号为201210295925.4、发明名称为“精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及蛋白表达领域，特别涉及精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法。

背景技术

精氨酸，学名为2-氨基-5-胍基-戊酸，是一种脂肪族的碱性的含有胍基的极性α氨基酸，在生理条件下带正电荷。L-精氨酸是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物必需氨基酸和生糖氨基酸，D-精氨酸在自然界中尚未发现。精氨酸中，与主链最接近的旁链部份是较长、有机及疏水的，而另一端的旁链则是一个胍基，这个胍基的酸度系数（pKa值）为12.48，在中性、酸性或碱性的环境下都是带正电荷的。因为在其双键及氮孤立电子对之间的共轭体系，使得其正电极离开原位，这个胍基能形成多重的氢键。

精氨酸的分子结构、电荷分布及形成多重氢键的能力，使得它能与带有负电荷的分子结合。因此，精氨酸在蛋白质的外围，能在带电荷的环境下产生相互作用。精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。作为一氧化氮的前体，精氨酸可以协助舒张血管。非对称性二甲基精氨酸（ADMA）会压抑一氧化氮的化学作用，所以ADMA被认为是血管疾病的标记，就像精氨酸是健康内皮细胞层的象征一样。细胞培植研究指出当有机体外（试管内）赖氨酸与精氨酸的比例偏向赖氨酸时，可以压抑病毒的复制。在治疗上的成效却是未知的，但食用精氨酸会影响注射赖氨酸的效用。病人在进行手术(如胆囊切除术)以前，如先补充30g的精氨酸，会使病人维持正氮平衡而易于恢复.对肿瘤病人在进行大手术前鼻饲匀膳时，补充25g的精氨酸比补充同样氮含量的甘氨酸有效得多，更易于保持氮的正平衡.要使精氨酸发挥上述功效，其剂量较大甚至要达到每千克体重0.5g。

氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽，例如甘精胰岛素前体和猪蛔虫抗菌肽cecropin P1，序列中含有连续的两个精氨酸。甘精胰岛素，化学名称为21A－Gly-30Ba-L-Arg-30Bb-L-Arg-人胰岛素，分子式为C₂₆₇H₄₀₄N₇₂O₇₈S₆，分子量为6063。甘精胰岛素是一种在中性pH液中溶解度低的人胰岛素类似物。在胰岛素与其受体结合的动力学方面，甘精胰岛素同人胰岛素极为相似。因此可以认为它与经由胰岛素受体而介导胰岛素的作用相同，其主要作用是调节糖代谢。通过促进骨骼肌和脂肪等周围末梢组织摄取葡萄糖、抑制肝葡萄糖的产生而降低血糖的。临床药理学的研究表明，静脉注射等剂量的甘精胰岛素和人胰岛素，其效价是相同的。像所有的胰岛素一样，甘精胰岛素的作用时程可能受体力活动及其他因素的影响。对健康人及I型糖尿病患者的正常血糖钳夹研究表明，皮下注射甘精胰岛素的起效时间比低精蛋白锌人胰岛素（NPH）胰岛素慢，但甘精胰岛素的作用特性为平稳、无峰值、作用时间长。甘精胰岛素前体经过酶切纯化后即可获得甘精胰岛素。而甘精胰岛素前体的表达，与胰岛素的表达方法相似，可以参照专利US5656722、US4916212、CN1614019和CN1854299等。实验发现，甘精胰岛素前体与胰岛素前体相比，表达量较低。

猪蛔虫抗菌肽cecropin P1是一种具有广谱抗菌作用的抗菌肽，能够有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长。重组猪蛔虫抗菌肽cecropin P1有希望在饲料中的获得应用。

通常，通用的发酵培养基或培养液中均含有细胞生长以及表达外源蛋白所需的碳源、氮源、无机盐以及微量元素等成分，但并不一定含有小分子氨基酸。但细胞在大量表达外源蛋白时，如猪蛔虫抗菌肽cecropin P1、甘精胰岛素前体，其对某种特定氨基酸的需求大幅增加，若不能通过现有营养满足，那么这种氨基酸将可能成为限制蛋白产量的重要因素。例如当生物合成多肽中出现两个连续的精氨酸时，可能受到供应的限制，从而在一定程度上制约了多肽生物合成的速度，此多肽的常规表达量较低。因此，在培养基或培养液中直接加入精氨酸，作为重组多肽合成的前体物质，有利于提高多肽的合成速率，促进表达水平的提高。