[发明专利]一种真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗遗传转化的方法

权利要求书

1.一种真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗心叶愈伤组织遗传转化的方法，包括如下步骤：

（1）甘蔗心叶胚性愈伤组织的诱导及增殖；

（2）含有目标基因的根癌农杆菌的活化与培养；

（3）真空渗透辅助农杆菌侵染甘蔗胚性愈伤组织；

（4）抗性材料的筛选与出苗；

（5）抗性植株鉴定；

其特征在于：

步骤（1）所述甘蔗心叶胚性愈伤组织的诱导及增殖方法是：

（1．0） 取甘蔗茎尖生长点以上不大于6cm的幼嫩心叶作为外植体，无菌条件下，将消毒好的外植体切成0.5～2.5mm的圆盘片；

（1．1） 将步骤（1．0）的外植体接种于愈伤诱导培养基上，置于26～28℃的黑暗条件下培养，挑选生长状况良好的胚性愈伤组织继代一次；

（1．2） 挑步骤（1．1）的生长状况良好的继代后胚性愈伤组织转接入新的愈伤诱导培养基上，进行活化培养；

愈伤诱导培养基是：MS  + 2,4-D （1～4）mg/L  + 蔗糖 30g/ L + 琼脂 （7～9）g/ L； 

步骤（2）所述含有目标基因的根癌农杆菌的活化与培养方法是：

（2．0） 挑取含有Bar基因的根癌农杆菌菌株EHA105的单菌落；

（2．1） 将步骤（2．0）的单菌落接入含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L的1ml YEP液体培养基中，在温度为26～28 ℃、震荡速度为200 rpm的条件下，培养3 ~ 4 小时；

（2．2）  取步骤（2．1）的菌液150 ~ 300μL，涂布于含Rif  50mg/L和Kan 50mg/L的YEP固体培养基上，在温度26～28 ℃下暗培养24～48小时，收集YEP固体培养基上的菌体；

（2．3） 将所收集的菌体转入100 ~ 200 ml含AS 150 μmol/L 的MS液体培养基，160~ 200 rpm振荡培养5 ~ 6 小时，菌液的OD₆₆₀值达到0.3 ~ 0.6为转化工程菌液；

将制备好的转化工程菌液分装到三角瓶中备用；

步骤（3）所述真空渗透辅助农杆菌侵染甘蔗胚性愈伤组织方法是：

（3．1） 将步骤（1．2）活化培养3～7天后的胚性愈伤组织无菌干燥处理后转入步骤（2）中装有制备好的转化工程菌液的三角瓶中，胚性愈伤组织和转化工程菌液在温度为22~28℃，震荡速度为80 ~ 100 rpm条件下共培养5 ~ 15分钟；后在0.02~0.06Mpa 无菌真空压力条件下辅助农杆菌侵染2~4分钟，重复2～3次；

（3．2） 步骤（3．1）菌侵染后的愈伤组织转入覆盖滤纸的共培养固体培养基上， 在温度为21~24℃下暗培养2~5天；共培养固体培养基是：MS  +  AS  150μmol/L；

（3．3） 将步骤（3．2）中的愈伤组织转接入恢复培养基上，在温度为26～28 ℃下暗培养5~7 天，恢复培养基是：MS  +  2,4-D （2~3）mg/L + Timentin （50~100）mg/L + 蔗糖30g/L；

步骤（4）所述抗性材料的筛选与出苗的方法是：

（4．1） 筛选培养，将经步骤（3．3）恢复培养后的愈伤组织转接入筛选培养基，2周后，挑选抗性愈伤组织于筛选培养基上进行继续筛选培养；筛选培养基是：MS+  2,4-D （2~3）mg/L + Timentin （50 ~200）mg/L + PPT （1~3）mg/L + 蔗糖30g/L）；

（4．2） 分化培养，将经步骤（4．1）2代筛选培养后的抗性愈伤组织转接到分化培养基上，在温度为26～28 ℃下、光强为1500lux、每天光照时间16小时的条件进行分化培养，分化出苗，获得抗性植株，分化培养基是：MS  +  6-BA （2~3）mg/L + NAA （0.1~0.3） mg/L +  Timentin （50 ~200）mg/L + PPT （1~3）mg/L + 蔗糖 30g/L；

（4．3） 抗性植株培养，将步骤（4．2）中生长到2 ~ 4厘米的抗性植株转入筛选培养基上，15天后抗性苗生根；筛选培养基是：MS  + NAA （2~3）mg/L  + Timentin （50 ~200）mg/L  + PPT （1~3）mg/L  +蔗糖 30g/L；

（4．4） 生根培养，将步骤（4．3）的抗性苗转到生根培养基进行生根培养；生根培养基，待根长3～5cm时，将瓶苗在温室中炼苗5～7天；生根培养基是：MS  + NAA （1~3）mg/L  + Timentin （50 ~ 200）mg/L  + PPT （1~3）mg/L  +蔗糖 50g/L；

（4．5） 将步骤（4．4）的瓶苗假植于苗圃基质中，获得抗性植株；

步骤（5）所述抗性植株鉴定的方法是：

将获得的抗性植株采用CTAB法提取DNA，用目标基因的特异引物进行PCR扩增，以pCAMBIA 3301质粒作为阳性对照，对抗性植株进行PCR检测；

取PCR阳性转基因植株叶片，提取RNA，根据目标基因特异引物进行RT-PCR分析；

取PCR阳性转基因植株叶片，用SDS方法大量提取DNA，进行southern blot 分析。