[发明专利]一种新型高效的蛋白酶活性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及功能纳米材料和生物化学领域，具体涉及一种新型高效的蛋白酶活性检测方法，本发明通过蛋白酶对多肽底物的酶切反应，用所得的酶切产物作为表面配体来合成具有荧光效应的纳米材料量子点，然后再根据所合成的量子点的荧光效应的变化，来反映酶切反应后产物的变化，从而来反映蛋白酶活性的变化。

背景技术

蛋白酶对蛋白质和多肽底物的特异性催化水解反应，对于生物体的正常生命活动发挥着极其重要的作用。检测酶含量及存在，很难直接用酶的量（例如质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定化学反应的能力来表示酶量，即用酶活性来表示。研究表明，蛋白酶活性的失调能够引起疾病，如癌症，炎症、退化性疾病等，这已经引起了科学家的广泛关注，因此在研究中需要检测蛋白酶的活性，检测蛋白酶的活性在蛋白酶活性相关疾病的医学诊断和工业生产方面都具有十分重要的意义。传统的酶活性检测方法，如免疫荧光吸附方法(简称ELISA)，Tothill的研究表明免疫荧光吸附方法虽然方便，但其灵敏度有限；Lamore S. D.提出虽然质谱和凝胶电泳方法的检测灵敏度高，但是需要昂贵的仪器设备，且不能定量；Lee J. S.等的研究表明荧光共振能量转移方法的灵敏度虽高，但由于底物的局限性，使其不具备普适性。因此，如何设计一种高效的、方便快捷、成本低的新型蛋白酶活性检测方法成为本发明研究的课题。

发明内容

本发明目的是提供一种新型高效的蛋白酶活性检测方法，其目的在于解决目前蛋白酶检测方法灵敏度有限、成本较高以及不具备普遍适用性的问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种新型高效的蛋白酶活性检测方法，有两个部分组成， 

第一部分：

事先建立所需检测的蛋白酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系，所述相关关系的建立由下列步骤组成：

第一步，针对所需检测的蛋白酶的种类，设计一段含有该蛋白酶特异性切割位点的多肽底物；

所述蛋白酶的种类是指具有特异性切割位点的胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一种；

所述多肽底物中包含一段由2~10个氨基酸构成的肽链，所述肽链中含有能够被所述蛋白酶特异性切割的肽键以及两个带有巯基基团的半胱氨酸，其中，肽链的两端分别是一个带有巯基基团的半胱氨酸；

第二步，在第一步的基础上，在所需检测的蛋白酶的最适温度以及最适pH值条件下，向多组相同量的多肽底物中各投入已知浓度的蛋白酶，各组已知浓度的蛋白酶之间具有浓度梯度，然后进行酶切反应，得到各组酶切产物，其中，多组已知浓度的蛋白酶中的最高浓度为所述多肽底物摩尔浓度的0.5%~10 %，设定的每一组酶切反应的时间相同并且小于或等于最高浓度的蛋白酶100%酶切多肽底物的时间；投入的所述多肽底物中含有的巯基基团的摩尔浓度在0.5 ~10mmol/L之间；

第三步，向所述各组酶切产物中投入相同量的用于合成量子点的具有金属离子和非金属离子的前驱体，并在25~100℃下反应0.5~1小时，各组反应结束后生成量子点，其中，投入的所述前驱体中金属离子的摩尔浓度为所述多肽底物中含有的巯基基团的摩尔浓度的85~120%，非金属离子的摩尔浓度为金属离子摩尔浓度的20 %~100 %；

所述金属离子的前驱体选自镉化合物、铅化合物、银化合物、锌化合物、铟化合物、汞化合物、铜化合物、锰化合物中的任意一种或任意两种，所述非金属离子的前驱体选自含硫化合物、含硒化合物、含碲化合物、含磷化合物、含砷化合物中的任意一种或任意两种；但任意两种金属离子的前驱体与任意两种非金属离子的前驱体不同时应用于一个合成量子点的反应；

所述量子点是二元量子点，具体为碲化镉、硒化镉、硫化镉、硫化铅、硒化铅、硫化银、硒化银、硫化锌、硒化锌、碲化锌、磷化镉、砷化镉、磷化铟、砷化铟中的任意一种，或者所述量子点是三元量子点，具体为镉汞碲、镉汞硒、镉汞硫、锌汞碲、锌汞硒、锌汞硫、锌镉碲、锌镉硒、锌镉硫，锌碲硒，锌碲硫、锌硒硫、镉碲硒、镉碲硫、镉硒硫、锌铜硒、锌锰硒、铜铟硫、铜铟硒中的任意一种；

第四步，对第三步中各组生成的量子点进行荧光光谱测定，得到所述量子点的荧光光谱波峰强度，再根据所需检测的多组蛋白酶的已知浓度，最终得到蛋白浓度与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系，即蛋白酶活性与对应产物合成的量子点的荧光光谱波峰强度之间的相关关系；

第二部分：