[发明专利]一种抗体人源化改造方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学、分子生物学和生物信息学领域，尤其涉及一种抗体人源化改造方法。 

  

背景技术

单克隆抗体类药物具有特异性强，副作用小，疗效显著等优点，已经成为对抗肿瘤，传染病，自身免疫病等病患的重要工具。目前细胞融合与杂交瘤技术，仍然是最为可靠的制备单克隆抗体的方法，常用来免疫的动物有小鼠，大鼠，羊，兔子及其他动物，其中最常用的是鼠类包括大鼠与小鼠。利用该方法得到的单克隆抗体是动物源的，开发动物源单克隆抗体成为抗体类药物应用于人体，必须要进行人源化改造，以减少异源抗体所引起的人抗动物抗体反应(Human Anti-Animal Antibodies, HAAA)，同时也可以更加有效的激活人体免疫系统，降低抗体类药物的清除速度，并延长半衰期。 

抗体人源化是一个古老的话题，但因为技术的限制，现有的人源化方法并不能保证100%得到人源化效果好亲和力高的抗体。常见的人源化方法有最早的嵌合抗体，CDR移植(CDR-grafting)改型抗体、表面重塑人源化抗体及噬菌体展示人源化抗体等，但是大量的实验结果表明现有的这些抗体人源化改造方法成功率有限，比如许多鼠源抗体进行CDR移植人源化改造后亲和力大大下降，甚至是特异性完全消失。 

具体地分析原因：这些传统的人源化方法大多数是基于一级结构序列分析或静态的三维分子结构分析进行的，这种分析策略存在主要问题就是无法解决抗体亲和力保持与人源化程度之间的矛盾，如：人鼠嵌合抗体亲和力保持最好，几乎与亲本鼠源抗体相同，但人源化程度很低，其完全的鼠抗体可变区依然会引起严重的(Human Anti-Mouse Antibody, HAMA)反应；CDR移植人源化抗体与噬菌体展示人源化抗体被认为是人源化程度最高的抗体，但这两种方法改造的人源化抗体往往亲和力下降严重，甚至是完全消失；表面重塑抗体人源化方法基于抗体分子三维结构分析，相对于CDR移植抗体来讲在亲和力保持上有一定优势，但其抗体内部依然存在大量的鼠源氨基酸，有报道认为也会引起一定的HAMA反应，其亲和力的保持是以牺牲一定人源化程度为代价的。 

抗体互补决定区(Complementary Determining Regions, CDRs)是在抗体框架区(Framework Regions, FRs)的支持下与抗原分子上的表位氨基酸相互作用的区域。CDR区与抗原表位精密的分子对接是抗体亲和力与特异性的分子基础，而天然的亲本抗体的CDRs区构象代表了最高的亲和力与最好的抗原结合特异性。理论上FRs区氨基酸的改变，会引起CDRs区构象上发生变化使亲和力下降。有研究证明，在FRs区的所有氨基酸中，大多数的氨基酸的人源化替换对CDRs区构象只产生轻微的影响，不会对抗体亲和力产物严重影响，但也存在着少数几个关键氨基酸，一旦这些关键氨基酸被替换成人的相应氨基酸后，会引起CDRs区构象上很大的改变，进而引起抗体亲和力的严重下降，现有的传统人源化方法正是无法动态地把握这些关键氨基酸，才会使其在人源化实验中往往导致人源化改造之后的抗体亲和力下降或消失。 

随着现代生物物理学、计算结构生物学的发展，使人们对于生物大分子的结构，功能及抗原抗体分子相互作用的认识更加透彻：利用同源建模(Homology Modeling)技术人们可以了解抗体分子及抗原分子的结构；利用分子动力学(Molecular Dynamics, MD)模拟技术，还可以掌握生物大分子的结构与功能之间的动态关系。将上述技术综合起来，再与生物信息学及生物学实验相结合，使解决传统人源化方法存在的问题提供了可能性。 

  

发明内容

本发明的目的是提供一种抗体人源化改造方法，在参考多模板进行CDR移植的基础上，以生物信息学中的表位扫描（Epitope Scaning，ES）技术和计算结构生物学中的虚拟突变与分子动力学模拟为核心，来进行合理的抗体人源化设计。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现： 

一种抗体人源化改造方法，包括以下步骤：

抗体基因序列分析，包括以下步骤：

1）抗体基因克隆：将动物源的分泌特异性抗体杂交瘤细胞提取总RNA，并反转录合成cDNA第一条链；根据不同动物源不同抗体亚型可变区设计特异性引物，以cDNA为模板，进行抗体基因PCR扩增，纯化后的PCR产物与克隆载体相连接，连接产物转化感受态细菌，在过夜生长的平板上轻链重链各挑取白色单菌落进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的克隆进行序列测定；

2）抗体序列分析