[发明专利]与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽及药物输送系统

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质多肽技术领域，尤其涉及一种与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽及药物输送系统。

背景技术

CD40L为肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员，为II型膜蛋白，主要表达在CD4+T细胞表面，包括Th0、Th1及Th2细胞亚群。CD40L也表达在其他淋巴细胞表面，如活化的CD8+T细胞或B细胞表面。研究表明，功能性的CD40L也表达在造血系中非淋巴细胞，如活化的血小板细胞的表面。活化的T细胞可在活化后十几分钟内瞬时表达CD40L，在6小时达到顶峰，随后表达量开始下降。

CD40/CD40L为特异性免疫反应系统中一对重要的共刺激分子，参与机体的体液免疫和细胞免疫反应。该信号通路可以上调活化T细胞表面共刺激分子B7（CD80/CD86）家族成员的表达；增加其他细胞表面CD23，CD54，CD95以及LT2β的表达；诱导免疫球蛋白IgG、IgA及IgE的同种型转换；避免B细胞因为Fas（CD95）或抗原诱导的IgM交联引起的凋亡；诱导B细胞的阴性筛选等。

CD40/CD40L信号通路与很多自身免疫性疾病相关，其异常可导致机体产生免疫病理反应。类风湿性关节炎（RA）患者关节液中的淋巴细胞CD40L表达量较正常人水平增加。在多发性硬化病（MS）中，同样检测到CD40L高表达的情况。相较于正常人，MS病人血液中淋巴细胞CD40L阳性T细胞率明显的增加，而且原表达CD40L的T细胞的表达水平也有所增加。由于CD40/CD40L信号传到通路与免疫系统疾病相关，大量研究针对阻断这一信号通路来完成对疾病的治疗。在与RA对应的CIA动物模型研究中，抗CD40L单克隆抗体可阻断CIA发生，包括抑制抗原递呈细胞产生IL-12，抑制IgG分泌和关节局部巨噬细胞产生NO，减少关节部位炎症细胞浸润。另外在对应MS的EAE小鼠模型研究中，抗CD40L的单克隆抗体不仅能在发病早期阻止EAE发生，包括抑制IL-12的分泌，阻止CD4+Th1细胞的活化，下调ICAM黏附分子的表达，减少单核细胞产生NO等。在后续相关的动物实验和临床实验中发现抗CD40L抗体发挥作用的机理除了阻断CD40/CD40L信号通路之外，外还包括抗体Fc段介导清除活化的CD40L+T细胞。

进入临床实验的几个抗体，都因出现了血栓的情况而暂停了临床试验。这一血栓的形成可能是因为抗CD40L抗体上的Fc段与血液中血小板上的FcRIIA受体结合，造成血小板之间的交联，导致血液凝集出现栓塞。后续在此基础上对抗体进行的改进，去除可以引起血栓的Fc段，只保留抗体上的Fab段，依然可以发挥其阻断CD40/CD40L信号通路的作用。但同时因为Fc段的去除，就无法达到CD40L+T细胞清除的效果。

针对阻断CD40/CD40L信号通路的抗体药物的缺陷和局限性，可以对其研究思路进一步的改造：1.筛选针对CD40L的配体多肽，将此多肽作为抗体的Fab段使用，达到阻断CD40/CD40L信号通路的效果。2.结合CD40L的靶向配体多肽与脂质体载药技术，通过多肽靶向高表达CD40L的细胞，针对性的释细胞毒药物，达到抑制CD40L+T细胞增殖的效果。目前已有针对CD40的三聚多肽出现，并在细胞水平上有效的抑制了CD40/CD40L信号通路，但并未有进一步的体内实验报道，另外也并未有针对CD40L的配体多肽来实现阻断CD40/CD40L信号同路的报道。

脂质体是和生物膜双层磷脂分子结构类似的的人工膜结构，内部形成封闭的囊泡结构，可以包裹水溶性的的药物，同时在脂质双分子层中也可以载入脂溶性药物。除了可以载药之外，脂质体还具有良好的生物相容性，经过DSPE-PEG2000等高亲水双性分子的修饰，延长其在血液中的循环时间，增加药物释放也作用时间。同时将靶向分子，如多肽，单抗等连接到脂质体上，制成具有主动靶向性的脂质体系统，能够识别靶细胞并且与细胞膜表面的受体分子结合，有利于脂质体内化，以促进药物在细胞内释放，从而提高药效。

由此，将CD40L靶向多肽与脂质体载药结合，实现CD40/CD40L信号通路的阻断和杀伤高表达CD40L+T细胞的效果。这样可以达到与CD40L抗体同样的治疗效果，但又可以避免抗体带来的凝血副作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够与CD40L蛋白特异性结合的配体多肽及药物输送系统。将该配体多肽与二硬脂酰甘油磷脂乙醇胺聚乙二醇马来酰亚胺连接，制成靶向合成材料，然后使用靶向合成材料进一步制备靶向脂质体，测定靶向合成材料和靶向脂质体对体内外细胞和CD40L高表达疾病模型的影响。