[发明专利]一种细胞外基质冷冻干燥保护液及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于医用生物材料保护技术领域，具体涉及一种用于细胞外基质冷冻干燥(简称冻干)的保护液及其使用方法。

背景技术

细胞外基质是由细胞分泌，可以通过特异的表面受体启动细胞内信号通路，调控细胞的分化、增殖、迁移、粘附等功能，其来源于天然组织，相比高分子合成材料具有良好的生物相容性。细胞外基质主要由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等成分组成；是通过物理、化学等手段将生物材料中的细胞成分去除获得，该类生物材料在临床修复和组织工程的组织构建中具有明显的疗效和优势；目前以细胞外基质为基础的上市产品有几十种，如小肠粘膜下层、真皮、血管、心脏瓣膜等。

虽然细胞外基质已广泛应用于临床，但是其保存方式一直存在问题，通常采用晾干或冻干两种方式。晾干的细胞外基质保留了基质蛋白的氢键及一些分子作用力，保护并维持了胶原的三级结构，但晾干的细胞外基质的保质期较短，仅是冻干保存方式的三分之一，因此给产品的销售带来困难。而冻干的细胞外基质虽然更利于运输和保存，但水分的丢失导致氢键被破坏，造成基质结构坍塌和功能破坏、丧失活性；而且结构的破坏是不可逆转的，即使复水后，也难以恢复到以前状态。

冷冻干燥技术(简称冻干)是将含水物质在低温下冻结，再于真空条件下使冰升华，从而除去物料中的吸附水，得到冻干制品。该技术已广泛应用于食品、药品、蛋白制品的冻干保护。

细胞外基质是一种大分子量、由一种或多种蛋白类分子组成的生物材料。在预冷、一次干燥、二次干燥和储存过程中，基质结构容易改变，导致基质变性。通常采用添加生物活性保护剂，如糖类、大分子聚合物、表面活性剂等，这些物质通过替代水分子与蛋白质形成羟基来平衡pH，降低蛋白质的表面张力，促进低温条件下玻璃态(玻璃态是保持液体结构的固体状态，液体在低温条件下形成玻璃态可避免冰晶的形成)的形成，保护蛋白质分子结构的稳定性，并且这些物质组成的保护剂对大部分的小分子活性蛋白能起到保护作用。

由于细胞外基质是以胶原为主的大分子蛋白，其结构致密，不易被糖类等冻干保护剂渗入，致使冻干效果不均一(指不同批次产品)，故对保护液的渗透压要求高。而且细胞外基质不溶于水，不能与冻干保护剂形成共熔点，因而在冷冻过程中保护剂与细胞外基质不能形成稳定的共态，因此针对可溶性小分子蛋白的冻干保护剂在用于细胞外基质时，所产生冰晶会损伤基质的三维结构，导致基质的物化性能改变。此外胶原分子表面带有大量正电荷，而糖类的电负性较弱，因此与胶原的粘附性弱，与水分子竞争性替代氢键的能力也较弱，对胶原分子的保护不充分，容易使胶原结构坍塌、活性下降。因此有必要针对细胞外基质的特性，开发出更合适的冻干保护液。

发明内容

针对现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种细胞外基质冷冻干燥保护液及其使用方法，用其在冻干过程中能够维持细胞外基质的生物活性和三维结构不被破坏，并使冻干程度均匀。

本发明所提出的细胞外基质冻干保护液是以生理盐水为溶剂，其组成包括：硫酸软骨素50～150mg/ml、维生素C 1～5mg/ml、聚乙二醇65～380mg/ml、海藻糖10～100mg/ml、葡聚糖10～30mg/ml、丝氨酸1～16μg/ml和苏氨酸1～16μg/ml。该保护液的配制对温度和组分顺序无特殊要求。

所述的细胞外基质冻干保护液组成的优化选择为：硫酸软骨素50～100mg/ml、维生素C 1～5mg/ml、聚乙二醇65～250mg/ml、海藻糖10～50mg/ml、葡聚糖10～30mg/ml、丝氨酸1～10μg/ml和苏氨酸1～10μg/ml。

本发明所述的冻干保护液，是根据细胞外基质的理化特性及其分子结构(氢键和极性基团)在冷冻、干燥过程中与功能变化机理专门设计，采用本发明保护液具有细胞外基质干燥均匀、含水率低、结构与功能损伤小的优点。

1)硫酸软骨素是细胞外基质组成的重要成分，起着维持细胞外基质结构的作用，而且其富含阴离子，能与胶原类蛋白有很好的粘附性；细胞外基质在低温干燥过程中，硫酸软骨素能在胶原蛋白表面形成膜结构，稳定细胞外基质的三级结构，并替代水分子与胶原形成氢键稳定分子的空间结构；电镜检测结果显示，采用硫酸软骨素保护的细胞外基质在冻干后更接近天然细胞外基质的结构。