[发明专利]一种高效免疫活性细胞群制备及用于抗肿瘤的方法

摘要

一种高效免疫活性细胞群制备及用于抗肿瘤的方法属于生物技术领域。是利用寡核苷酸及细胞因子诱导树突状细胞，用细胞因子诱导杀伤细胞，然后将树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞按一定比例混合培养，得到一种新的免疫效应细胞群寡核苷酸诱导的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养所获得的细胞群。这种细胞与细胞因子诱导杀伤细胞细胞和树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养的免疫细胞群比较，增殖活性更强，细胞毒活性远高于细胞因子诱导杀伤细胞。寡核苷酸能够人工合成，对丧失手术时机以及难以得到肿瘤抗原的病人同样可以诱导和扩增出远高于细胞因子诱导杀伤细胞的抗癌活性的免疫细胞群。适用于自体瘤治疗、化疗和放疗的辅助治疗。

主权项

1.一种抗肿瘤高效免疫活性细胞群的制备方法，其特征在于，步骤是：(1)外周血单个核细胞的制备：取肿瘤病人抗凝外周血20-50ml，用生理盐水对倍稀释后，用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，分离所用离心机之转头为水平转头，离心速度为2000rpm，离心20分钟，然后用Hanks平衡液洗涤2-3次再进行显微镜下细胞计数，最后用淋巴细胞培养液调整细胞密度成3-5×10-6/ml的细胞悬液。(2)外周血淋巴细胞和粘附细胞的分离：将前述细胞悬液移入6孔板，每孔3-5ml，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱温育2-3小时，然后用移液管轻轻冲洗细胞，将非黏附PBL悬液收集在50ml离心管中，田孔板留下的粘附细胞作诱导树突状细胞用。(3)细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导和扩增：在上述外周血淋巴细胞悬液中添加重组人干扰素，终浓度为1000单位/毫升，然后移入表面积为75平方厘米的培养瓶中，每瓶装量20毫升，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中温育24小时，然后添加CD3单抗、白细胞介素-1和白细胞介素-2，终浓度分别为50纳克/毫升、100微克/毫升和800单位/毫升，继续培养48-72小时后，显微镜下细胞计数，然后用细胞因子诱导的杀伤细胞培养液调解细胞浓度为2×10-6/毫升，分配到75平方厘米培养瓶中，每瓶20毫升，进行扩大培养；细胞因子诱导的杀伤细胞培养液含完全F12/DMEM1∶1，或者AIM-V，含白介素-1和白介素-2。此后，每瓶48-72小时按上述相同条件扩大培养一次。培养至第8天收集细胞因子诱导的杀伤细胞细胞待用。(4)树突细胞的诱导和扩增在前述留有粘附细胞的6孔板中，每孔加入树突细胞培养液3毫升。树突细胞培养液为重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4，终浓度分别是1000单位/毫升和500单位/毫升。置于6孔板与37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养3天，然后在各孔中加入细胞因子诱导的杀伤细胞培养液；细胞因子诱导的杀伤细胞培养液为完全F12/DMEM1∶1，或者AIM-V，含白细胞介素-1和白细胞介素-2。再加入寡核苷酸2006，终浓度3微摩尔/毫升，继续培养，至第5天，加入肿瘤坏死因子，终浓度为100单位/毫升。培养至第8天，用移液管冲洗和收集非粘附和半粘附树突细胞待用。(5)树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养制备寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞群。培养液为完全F12/DMEM1∶1，或者AIM-V，含白细胞介素-1和白细胞介素-2。将经过寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞，分别计数，离心弃上清后，分别用细胞因子诱导的杀伤细胞培养液调节细胞密度为6×10-5/ml和2×10-5/ml。等体积混合后移入75平方厘米培养瓶中，每瓶20ml，置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每隔48-72小时按以上细胞密度分瓶扩大培养一次，培养至2-3周单次或分次回输体内。