[发明专利]检测膜通道蛋白与靶向药物的相互作用的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测膜通道蛋白与靶向药物的相互作用的方法及其应用。

技术背景

细胞电压门控钠通道（VGSCs）在神经元和其他可兴奋性细胞动作电位形成和传导过程中有非常重要的作用，其细微变化或表达异常都会导致功能改变，是导致癫痫、疼痛、先天性肌肉强直症、周期性瘫痪等各种疾病的关键因素，一直是研究的热点。但是在长期的进化和演变中，钠通道形成了一系列亚型，广泛分布在生物体各个组织中。其亚型的多样性使得研究过程中针对亚型的区分和鉴定尤为重要，而特异性通道靶向药物则成为不可或缺的工具。

钠通道靶向药物能够针对钠通道不同的亚型，具有各种不同的结合位点和作用方式，使得能够通过两者之间相互的结合和作用，成为钠通道亚型区分和鉴定的探针，同时也是研究钠通道功能的工具。

BmK I是由东亚短钳蝎中提取分离得到的钠通道特异性靶向药物，是一个由60-70个氨基酸组成的长链肽类，能够作用于钠通道，改变钠通道的电生理特征，显著延缓其失活过程。其机理是由于：钠通道由一个形成孔道的功能性α亚基，一个或数个辅助β亚基组成。α亚基是钠通道行使功能的关键亚基，由四个高度同源的结构域（DⅠ-DⅣ）组成，每个结构域含有六个跨膜α螺旋片段（S1-S6）。在其结构上目前已经鉴定了至少七个通道靶向药物的受体位点。

SPR技术可以观测生物分子的动态结合，实验时将一种生物分子固定在特殊的芯片上，利用液体传送系统将溶解有另一种生物分子的结合缓冲液流经芯片，当溶液中的分子与固定在芯片上的分子相互结合时会改变芯片表明的溶液折射率（Resonance Unit，RU），折射率的变化与结合在芯片表面的生物分子质量成正比。仪器通过跟踪检测折光率的变化，进而分析出生物分子之间结合、解离的整个过程。SPR技术能够实时检测生物分子间的相互作用，不必使用任何标记，能够保证生物分子的天然活性。

全细胞膜片钳能够进行单个细胞的电生理记录，通过给予单个细胞电刺激（一定阈值的电压或电流刺激），或化学刺激（特异性靶向药物等）可以记录到由离子通道开放关闭所引起的电流或电压信号，这一信号即可反映离子通道的电生理学性质，是研究离子通道性质的重要指标。而膜通道靶向药物作用于通道之后，可以引起通道电生理学性质的改变，从而为研究离子通道提供依据。

钠通道作为一个大分子量的膜蛋白（260KD），如何能够分离纯化而不影响其活性，保证其完整的结构，是目前尚未解决的难题，而SPR技术检测动态结合，往往是需要能够获得待研究的生物分子样本，因此膜通道蛋白分离纯化的难题，在某种程度上就制约了它的使用，本发明利用人工合成关键结合序列肽链的方法，克服了此类限制，并成功验证了其可行性，使得利用SPR技术 研究膜通道蛋白与其靶向药物结合成为可能。

发明内容：

本发明的目的之一在于提供一种检测膜通道蛋白与靶向药物相互作用的方法。

本发明的目的之二在于提供该检测方法的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下实验方案：

一种检测膜通道蛋白与靶向药物相互作用的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 根据膜通道蛋白上与其靶向药物相互作用位点上的关键氨基酸序列，合成肽链；

b.采用表面等离子共振技术检测步骤a所得的肽链与靶向药物的相互作用。

上述的膜通道为细胞电压门控钠通道，该通道的位点3与其靶向药物相互作用的关键氨基酸序列为DⅣ/S3-S4胞外环，根据该关键氨基酸序列设计的两段肽链为：

rNav1.5  SIVGTVLSDIIQKYFFSPTL

rNav1.8  SIGSLLFSAILKSLENYFSPTL；

所述的靶向药物为钠通道靶向药物BmK I。

上述的步骤b的具体方法为：

a. 靶向药物的芯片固化：

注入400mM的N-ethy1-N-(dimethylaminepropyl)-carbodiimid和100mM的N-hydroxy-succimide的按1: 1的体积比混合成的混合液，激活CM5传感器芯片上的偶联基团-COOH；将靶向药物以23μg/ml的配置浓度置于pH5.0、10mM醋酸钠溶液中，取30μl注入芯片；