[发明专利]蓝莓提取物用于预防阿尔茨海默病

说明书

技术领域

本发明属于药学领域。具体涉及蓝莓提取物对β-淀粉样蛋白及同型半胱氨酸诱导的PC12细胞损伤的保护作用。 

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种神经退行性疾病。主要的临床表现为认知和记忆功能不断恶化，并伴随各种神经精神症状和行为障碍。在我国65岁以上的老年人中患病率约为5％。AD的主要病理特征之一是在大脑皮层和海马出现由β-淀粉样蛋白(Aβ)聚积形成的老年斑(SP)。大量研究已经表明，Aβ在AD的病中起着相当重要的作用。Aβ的神经毒性能引起氧化应激，线粒体损伤，激活凋亡因子，启动细胞的凋亡。同时，临床研究证明血浆中同型半胱氨酸水平增高可增加AD的发病率。因此，减少Aβ的生成，抑制Aβ或同型半胱氨酸引起的神经损伤是研究AD治疗的热点之一。 

目前治疗AD的药物主要是神经营养药、拟胆碱药或胆碱酯酶抑制剂，均属对证治疗药物，不能减缓AD病情的发展。蓝莓(Vaccinium myrtillus L.)制剂现已广泛用于各种保健品，可预防眼科及心血管方面的疾病。然而蓝莓提取物对AD的预防作用还未见报道。 

发明内容

本发明的目的是为蓝莓物用于预防海默病提供细胞水平的依据。发明人经过多次药理学实验，发现含25％总花青素的蓝莓提取物可有效对抗Aβ_25-35及同型半胱氨酸引起的细胞毒性，抵制细胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3的表过。该药理作用在本发明以前尚无文献报道。 

附图说明

图1，和对照组比较，经Aβ_25-35处理后细胞核出现凋亡特征：表现为细 胞核变小或破碎，荧光增强。蓝莓提取物预处理可有效抑制Aβ_25-35诱导的细胞凋亡。蓝莓提取物对Aβ_25-35诱导的PC12细胞凋亡的影响(A：对照组，B：Aβ_25-35处理组，C：25μM蓝莓提取物预处理组，D：50μM蓝莓提取物预处理组) 

图2，和对照组比较Aβ_25-35处理后PC12细胞caspase-3的表达显著增高。蓝莓提取物预处理可有效降低caspase-3的表达。 

蓝莓提取物抑制Aβ_25-35诱导的caspase-3表达增高。 

具体实施方式

细胞培养：PC12细胞于37℃、5％CO₂培养箱培养。培养基为含8％胎牛血清，8％马血清的DMEM培养液。取对数生长期的细胞以1×10⁴/100μl接种于96孔板，37℃培养24h。 

药物处理：蓝莓提取物由香港东方保健品公司提供。细胞加入终浓度为0-50μM的蓝莓提取物，培养24h以观察蓝莓提取物的细胞毒性。细胞先不同浓度的蓝莓提取物预处理1h，再加入0.5μM Aβ_25-35或5mM同型半胱氨酸继续培养24h以观察蓝莓提取物对Aβ25-35及同型半胱氨酸毒性的对抗作用。 

MTT细胞活力测定：药物处理后，去除培养液，每孔加入50μlMTT溶液(终浓度0.5mg/ml)，37℃培养4h后，每孔加入50μlMTT裂解液(20％SDS，50％DMFpH4.7)，37℃反应过夜。酶标仪检测各组细胞570nm的OD值。将OD值转换为百分比(％)。未经药物处理的细胞OD值设为100％。每组6空对照，结果用 表示。 

荧光显微镜检测细胞凋亡：将生产良好的PC12细胞接种于6孔板，37℃孵育24h。分组及药物处理同上。弃除培养液，用4％多聚甲醛于4℃固定30min。用磷酸缓冲液(0.1M PBS，pH7.4)漂洗后，加入终浓度为5μg/ml的Hochest33258避光染色10min，PBS漂洗后封片，荧光显微镜观察细胞核凋亡。 

Western blot检测caspase-3的表达 

方法：将生长良好的PC12细胞接种于6孔板，37℃孵育24h。分组及 药物处理同上。用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。电泳后蛋白转移至PVDF膜，用含5％脱脂牛奶的TBST缓冲液(含0.05％Tween20的TBS缓冲液)室温封闭1h。将膜与溶解于TBST缓冲液的caspase-3一抗4℃孵育过夜。TBST洗涤5min×3次后，将膜与溶解于TBST缓冲液的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h。TBST洗涤5min×3次，用ECL化学发光法检测蛋白表达。 

附图1说明：