[发明专利]高密度粪肠球菌及其发酵培养工艺

说明书

技术领域：本发明涉及饲料级微生物及其发酵培养工艺，特别是高密度粪肠球菌及其发酵培养工艺。

背景技术：粪肠球菌（Enterococcus faeccalis)，也叫粪链球菌，是我国农业部允许使用的16种饲料用微生物品种之一，美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)则公布了44种“可直接饲喂且通常认为是安全的微生物(Generally Recognized as Safe，GRAS)”作为微生态制剂的出发菌株，其中均有粪肠球菌。

 粪肠球菌作为农业部批准使用的有益微生物菌种之一，已被广泛应用于养殖业中，为减少和避免使用抗生素发挥了很大作用。但现有工艺生产的粪肠球菌其质量要求中的一项为有效活菌数不足，直接影响其使用效果和推广应用。

经过广泛不完全收集统计国内厂商样品，发现国内固态发酵工艺生产厂家所生产产品含活菌量仅为20～30亿/克的水平，且在保存期衰减损失率大，特别是经85℃高温处理的损失率更大；未见粪肠球菌采用高密度固态发酵培养工艺生产的报道。

  粪肠球菌的研究在国外起步较早，在国内则尚处于研究初级阶段，国外最为先进和著名的产品有瑞士百福门生物公司(Cerbios-Pharma S.A.Swizerland）于2001年进入中国市场的产品：“LBC ME10”，农业部批准文号为：(2001)外饲准285号。赐美健LBC ME10的特点是菌数含量高，活力强，并采用菌种多层包埋技术对细胞进行保护，其含活菌量可达到100亿/克。

目前现有的粪肠球菌生产普遍采用液体深层发酵培养工艺，其存在发酵工艺生产设备投资大，原料及能源消耗量大，且生产出的产品保存性差，球菌活性不高，其含活菌量少，最高为100亿/克。

发明内容：本发明内容是提供一种高密度粪肠球菌及其发酵培养工艺，用高密度固体发酵培养工艺，具有投资少、节能减排、清洁环保、产品保存性好，活性高,产品含活菌量高等特点。

本发明一种粪肠球菌发酵培养工艺是采用固体发酵培养工艺，包括：

1）以米糠、麸皮、玉米粉、豆粕中任意一种或几种原料，和活性炭作固态培养基料；

2）于固态培养基料中加入营养液培养基作为固态发酵培养基；

3）将固态发酵培养基灭菌后,接种粪肠球菌种液,经培养,干燥，粉碎制得高密度粪肠球菌产品； 

 所述的营养液培养基各质量组分组成为：葡萄糖：5～20.0，蛋白胨：1～10.0，牛肉膏：1～5.0，酵母膏：1～5.0，硫酸镁0～0.5，硫酸锰0～0.2，磷酸氢二钾：0.5～3.0，去离子水1000，pH6.0～7.5；

所述的粪肠球菌种液为用MRS液体培养基培养再接种粪肠球菌制得。

本发明高密度粪肠球菌发酵培养工艺，优选所述固体发酵培养工艺，包括：

1）固态培养基料各组分组成按质量比为  米糠:麸皮:玉米粉:豆粕:活性炭 = 1：1.5～2.5: 1.5～2.5:2.5～3.5:1.5～2.5的比例混合；

2）于上步固态培养基料中按质量比固态培养基料：营养液培养基为1：1～1.5的比例加入营养液培养基，并加入饲料用稀土添加剂，制成固态发酵培养基； 

3）将2）步制得的固态发酵培养基，湿热灭菌，冷却后接种粪肠球菌种液，培养，干燥，粉碎制得粪肠球菌产品；

所述的粪肠球菌种液是用MRS液体培养基，经灭菌冷却后，接种粪肠球菌斜面种子，在30℃～40℃温度，180rpm转速下,于摇床上培养18～20小时制得。

本发明所述3）步固态发酵培养基经灭菌冷却后，接种粪肠球菌种液，粪肠球菌种液接入量为固态发酵培养基质量的5～20%，培养过程中控制培养温度30～40℃，时间20～72小时。

本发明所述3）步的培养过程中至少进行一次以上营养液培养基的流加操作。

本发明所述的活性炭为颗粒状活性炭,其颗粒直径控制在3～8mm。

本发明3）步所述的干燥粉碎是发酵培养后，物料于35～50℃下通风干燥至含水量10%以下，再粉碎至60～80目即为粪肠球菌成品。

本发明所述2）步饲料用稀土添加剂为含有镧、铈有效元素的饲料用稀土添加剂；添加剂加入量按质量比是固态培养基料：营养液培养基：饲料用稀土添加剂为1：1.0～1.3：0.00008～0.00015。