[发明专利]一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法，是利用启动子置换技术提高淀粉液化芽孢杆菌的脂肽类抗生素fengycin产量方法，属于生物技术领域。 

二、背景技术

【文摘】1968年Arima(Biochemical and Biophysical Research Communication，1968，31：488-496.)等首次发现枯草芽孢杆菌(B.subtilis)能够产生抗菌脂肽surfactin以来，抗菌脂肽产生菌的筛选主要集中在枯草芽孢杆菌的不同菌株之间(中国农业科学，2003，(12)：1496-1501.微生物学报，2003，43(5)：647-652.)。近年来，进一步的研究表明，除枯草芽孢杆菌外，淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)(Phytichemistry，2002，61：693-698.)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)(Journal of Fermentation andBioengineering，1992，74：255-216)等也能产生抗菌脂肽。 

抗菌脂肽一般是革兰氏阳性芽孢杆菌产生的代谢产物。抗菌脂肽的分子是由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，【文摘】抗菌脂肽除了具有抗菌活性之外还具有生物表面活性剂的特性(MolecularMicrobiology，2005，56：845-857.精细化工，2006，(2)：121-125.)，在医药(AppliedMicrobiology and Biotechnology，1999，51(5)：553-563.The Journal of Antibiotics，1986，39：755-761)、农业(Phytichemistry，2002，61：693-698)、食品及化妆品(食品工业科技，2006，4：91-93.]、石油开采(微生物学杂志，2005，2：4-8农业生物技术学报，2004，(3)：330-333.)和环境治理(Journal of hazardous materials，2001，85(1-2)：111-125)等领域有重要的应用前景，已引起广泛的关注。 

其中fengycin等抗菌脂肽具有强烈的抗丝状霉菌作用，已有许多用来抑制植物病原菌的研究实例。因此，fengycin在植物病害生物防治方面具有重要的应用前景。对农业生产具有重要的意义。 

但是，通常的菌株一般抗菌肽产量很低，迄今为止，脂肽产生菌的产量一般低于1.0g/L，少的甚至在0.1g/L以下，因此，需要对生产菌株进行诱变，在这方面已有少量尝试，并取得了良好效果(Journal ofNatural Products，2002，63：1492-1496)。此外，随着对抗菌脂肽的合成机理的认识和合成酶基因的定位、克隆和表达的成功，人们开始采用基因工程的手段构建基因工程菌株用于抗菌脂肽的生产(中国农业科学，2003，(12)：1496-1501)。 

同源整合技术就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。它克服了随机整合的盲目性和危险性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、可诱导性基因同源整合系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。【文摘】(APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Aug.2005，p.4577-4584.J.Bacteriol.183：6265-6273.)。目前已有通过同源整合技术使强启动子来置换抗菌肽合成酶操纵子的启动子，并提高了该抗菌肽的产量。 

三、发明内容

技术问题 

本发明的目的是通过分子生物方法提高fengycin合成酶基因簇的表达，获得fengycin产量提高的淀粉液化芽孢杆菌置换菌株。 

技术方案 

一种提高淀粉液化芽孢杆菌fengycin产量的启动子置换方法，是将野生型淀粉液化芽孢杆菌ES-2的fengycin合成酶基因的启动子Ppps置换为启动子P59的方法。其特征在于， 

1)启动子P₅₉序列的克隆 

设计启动子P₅₉的引物： 

上游引物：5’-ctttattgttttgccatt-3’