[发明专利]重组蛛毒蛋白、其制备方法和表达载体以及用于治疗ED的药物

说明书

技术领域

本发明涉及生化领域，具体而言，涉及一种重组蛛毒蛋白、其制备方法和表达载体以及用于治疗ED(男性勃起功能障碍)的药物。

背景技术

阴茎勃起是神经-内分泌调节下勃起器官阴茎海绵体的血流动力学变化过程。当受到性刺激后，非肾上腺素非胆碱能神经元在一氧化氮合酶(NOS)的催化下合成释放一氧化氮(NO)；副交感神经末梢释放的已酰胆碱激活阴茎海绵体窦及血管内皮细胞一氧化氮合酶催化下促进NO合成和释放。NO扩散到阴茎海绵体平滑肌细胞内，激活鸟苷酸环化酶，使三磷酸鸟苷转化为环磷酸鸟苷(cGMP)。细胞内cGMP浓度增加，使胞浆内钙离子浓度降低，导致海绵体平滑肌松弛，阴茎海绵体窦膨胀，动脉血流增加而阴茎海绵体容积增大。随着阴茎海绵体体积增大，围绕阴茎海绵体的白膜被动延伸拉长，使引流海绵体血液的白膜下导静脉受压延伸变窄，静脉回流阻力增加，阴茎海绵体压力增强而诱发阴茎勃起。随着cGMP被平滑肌细胞内磷酸二酯酶V型(PDE-5)降解，丧失其活性以及射精后交感神经恢复紧张性，阴茎转入疲软状态。在这个过程中，cGMP能够被磷酸二酯酶(PDE-5)所灭活，从而使阴茎转入疲软状态。

某些种类的蜘蛛毒素对男性生殖系统的影响早已有报道，在拉美地区，被塔兰图拉蜘蛛咬伤的男性患者常常会经历几个小时的强制性阴茎勃起。在巴西、阿根廷和以色列的多个医院，医生已经展开多年的临床应用，用蜘蛛毒素治疗男性勃起障碍。蜘蛛毒蛋白种类非常多，研究业已证明，对此功能起主要作用的活性物质是只是漏斗网蛛毒素中的一个组分。我们用动物实验已经证明重组蛛毒蛋白对于勃起障碍也具有活性。

在实现本发明过程中，发明人发现自然界中蜘蛛毒蛋白资源有限，且分离困难，其活性和稳定性都很难得到保证。这种动物来源的蛋白在人体使用，会引起不同程度的免疫排斥反应和潜在的病源传播的危险。

发明内容

本发明旨在提供一种重组蛛毒蛋白、其制备方法和表达载体以及用于治疗ED的药物，以解决自然界中蜘蛛毒蛋白的问题。

在本发明的实施例中，提供了一种重组蛛毒蛋白，其由多肽链构成，多肽链包含由以下48个氨基酸构成的序列：ATCAGQDQPCKETCDCCGER GECVCGGPCI CRQGYFWIAW YKLANCKK(在本发明中，命名为PnTx2-6-β)。

在上述的重组蛛毒蛋白PnTx2-6-β中，多肽链可以由48个氨基酸构成的序列所构成。

在上述的重组蛛毒蛋白中，多肽链可以进一步包含以下34个氨基酸构成的序列：MKVAILFLSI LVLAVASESI EESRDDFAVEELGR，该34个氨基酸构成的序列和的48个氨基酸构成的序列共同构成82个氨基酸构成的序列：MKVAILFLSI LVLAVASESIEESRDDFAVE ELGR ATCAGQDQPC KETCDCCGERGECVCGGPCI CRQGYFWIAW YKLANCKK(在本发明中，命名为PnTx2-6-α)。

在上述的重组蛛毒蛋白PnTx2-6-α中，多肽链可以由82个氨基酸构成的序列所构成。

在本发明的实施例中，还提供了一种重组蛛毒蛋白的制备方法，使用大肠杆菌进行表达制备上述的重组蛛毒蛋白PnTx2-6-β，其包括以下步骤：

步骤i.人工合成以下DNA片段，

1   gccacatgcg ctggccaaga ccagccctgc aaagaaactt gcgactgctg tggagagaga

61  ggagaatgtg tttgcggagg accttgcatt tgcaggcaag gctacttttg gatagcatgg

121 tataaacttg ctaactgtaa aaaatga

步骤ii.以该DNA片段为模版，扩增出包含

gc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg

agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta

taaacttgct aactgtaaaa aatga

的核苷酸序列，回收核苷酸序列，在多克隆位点将其插入原核表达载体中得到重组表达载体；

步骤iii.用氯化钙法制备DH5α感受态细胞后，用前述重组表达载体转化DH5α感受态细胞，在抗性平板中挑取单菌落，经过培养后抽提得到质粒；