[发明专利]重组蛛毒蛋白、其制备方法和表达载体以及用于治疗ED的药物

权利要求书

1.一种重组蛛毒蛋白，其特征在于，其由多肽链构成，所述多肽链包含由以下48个氨基酸构成的序列：ATCAGQDQPCKETCDCCGER GECVCGGPCI CRQGYFWIAWYKLANCKK。

2.根据权利要求1所述的重组蛛毒蛋白，其特征在于，所述多肽链由所述48个氨基酸构成的序列所构成。

3.根据权利要求1所述的重组蛛毒蛋白，其特征在于，所述多肽链进一步包含以下34个氨基酸构成的序列：MKVAILFLSILVLAVASESI EESRDDFAVE ELGR，该34个氨基酸构成的序列和所述的48个氨基酸构成的序列共同构成82个氨基酸构成的序列：MKVAILFLSI LVLAVASESI EESRDDFAVE ELGRATCAGQDQPC KETCDCCGER GECVCGGPCICRQGYFWIAW YKLANCKK。

4.根据权利要求3所述的重组蛛毒蛋白，其特征在于，所述多肽链由所述82个氨基酸构成的序列所构成。

5.一种重组蛛毒蛋白的制备方法，其特征在于，使用大肠杆菌进行表达制备权利要求1或2所述的重组蛛毒蛋白，其包括以下步骤：

步骤i.人工合成以下DNA片段，

1   gccacatgcg ctggccaaga ccagccctgc aaagaaactt gcgactgctg tggagagaga

61  ggagaatgtg tttgcggagg accttgcatt tgcaggcaag gctacttttg gatagcatgg

121 tataaacttg ctaactgtaa aaaatga

步骤ii.以该DNA片段为模版，扩增出包含

gc cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg

agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta

taaacttgct aactgtaaaa aatga

的核苷酸序列，回收所述核苷酸序列，在多克隆位点将其插入原核表达载体中；

步骤iii.用氯化钙法制备DH5α感受态细胞后，用所述构建好的表达载体转化所述DH5α感受态细胞，在抗性平板中挑取单菌落，经过培养后抽提得到的质粒；

步骤iv.将所述质粒转化入感受态Rosetta 2大肠杆菌，从转化后含有正确表达所述质粒的抗性平板中挑取单菌落，接种于含葡萄糖和抗生素的LB或TB培养基中，在20-37℃的条件下以100-300rpm的转速在气浴或水浴中培养至OD600＝1.2，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养4小时，然后以4℃2000g离心10分钟，收集得到的菌体；

步骤v.将所述菌体与100mMNaCl，50mMTris pH8.0混合，采用细胞破碎技术将细胞进行破碎，以12000rpm离心，收集上清，然后经亲和层析柱、离子交换柱和凝胶排阻色谱进行层析纯化，并经过无菌过滤后，在-30℃至7℃冻干，得到权利要求1或2所述的重组蛛毒蛋白。