本发明提供一种番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)双重实时荧光定量PCR检测引物及方法,其中,MDPV引物序列如下:上游引物P1:TAATGGTGGCAGGAATGCACAGTTC,下游引物P2:TGTTACCATGATGTCTGAAAT;GPV引物序列如下:上游引物P3:GAGGTAGACAGCAACAGAAA,下游引物P4:GCTCGTCCGTGACCATA。目前,还没有基于SYBR Green II的双重实时荧光定量PCR检测引物及方法可以同时将GPV各种基因亚型完全地和MDPV区分开来的相关研究报道和发明专利,本发明的建立可填补相关领域空白。
本发明公开了一种同时检测MDPV和GPV两种病毒的微滴数字PCR(ddPCR)试剂盒及其检测方法,所述试剂盒包括如序列表中SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6所述的引物和探针,本发明方法针对MDPV的VP1基因组和GPV的VP3的基因组区域设计引物对和探针,并且优化用于微滴数字PCR检测的扩增反应液组成和配比、微滴生成和PCR扩增步骤的工作条件,得到一种能够同时检测MDPV和GPV两种病毒的微滴数字PCR检测方法,并且其具有具有特异性好、绝对定量、无需阳性对照、对PCR抑制剂的耐受力好等优点,为MDPV和GPV病毒的快速、准确的检测、监测和流行病学调查提供了有效的技术手段。
所述试剂盒包含了四类鸭源细小病毒(MDPV、N‑MDPV、GPV和N‑GPV)和近年来新发现的鸭依赖病毒(DAAV)通用型的引物对,序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明采用的特异性引物可对四类鸭源细小病毒(MDPV、N‑MDPV、GPV和N‑GPV)和近年来新发现的鸭依赖病毒(DAAV)进行有效扩增,可快速判断待检样品中是否存在上述病原感染。