本发明涉及体外分子检测的技术领域,公开了一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法,所述核酸组合物包括以下序列:CB2F:SEQ ID No:1;CB2R:SEQ ID No:2;CB2P:SEQ ID No:3;CB3F:SEQ ID No:4;CB3R:SEQ ID No:5;CB3P:SEQ ID No:6;CB4F:SEQ ID No:7;CB4R:SEQ ID No:8;CB4P:SEQ ID No:9;CB5F:SEQ ID No:10;CB5R:SEQ ID No:11;CB5P:SEQ ID No:12。