本发明公开一种新型阿魏酸酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；本发明还公开了所述新型阿魏酸酯酶的DNA，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了含有上述新型阿魏酸酯酶DNA的表达载体、重组阿魏酸酯酶及其制备方法，以及所述重组阿魏酸酯酶在降解植物细胞壁中的应用。本发明所述新型阿魏酸酯酶与重组阿魏酸酯酶在大肠杆菌表达体系中高效可溶性表达，所述重组阿魏酸酯酶能够从20mg去淀粉麦麸中释放16.3±0.9μg阿魏酸，占其中所述阿魏酸总量的16％。
本发明公开了一种阿魏酸酯酶及其突变体N.9‑98与应用。所述的阿魏酸酯酶具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，其性质稳定，反应pH为6‑8，反应温度为37‑54℃。本发明在所述的阿魏酸酯酶的氨基酸序列的基础上分别通过增加阿魏酸酯酶中二硫键的数量、改变其碳水化合物结合模块的侧链基团以及改变催化结构域电荷，得到了阿魏酸酯酶突变体N.9‑98，与原始阿魏酸酯酶相比，此突变体的比酶活均得到明显提高本发明得到的阿魏酸酯酶以及突变体性质稳定，有助于阿魏酸酯酶的工业化应用。
本发明公开了一种阿魏酸酯酶及其突变体N.7‑16与应用。所述的阿魏酸酯酶具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其性质稳定，反应pH为6‑8，反应温度为37‑54℃。本发明在所述的阿魏酸酯酶的氨基酸序列的基础上分别通过增加阿魏酸酯酶中二硫键的数量、改变其碳水化合物结合模块的侧链基团以及改变催化结构域电荷，得到了阿魏酸酯酶突变体N.7‑16，与原始阿魏酸酯酶相比，此突变体的比酶活均得到明显提高本发明得到的阿魏酸酯酶以及突变体性质稳定，有助于阿魏酸酯酶的工业化应用。
本发明涉及一种利用大肠杆菌生产胞外阿魏酸酯酶的方法。该方法包括如下步骤：(1)制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述的阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)将步骤(1)制得的重组大肠杆菌经IPTG或乳糖诱导发酵，经去除菌体，纯化，制得阿魏酸酯酶。本发明首次通过采用限制性内切酶Nde I酶切阿魏酸酯酶基因后，核糖体结合位点后的首个酶切位点变为Nde I酶切位点，从而获得的阿魏酸酯酶具有天然的N端序列；该特殊结构使得阿魏酸酯酶能够在大肠杆菌合成后分泌至胞外，从而极大简化了阿魏酸酯酶的纯化和利用，对后续阿魏酸的工业化生产具有显著的促进作用。
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种冠突曲霉阿魏酸酯酶基因及其工程菌和应用。本发明所述阿魏酸酯酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因编码的阿魏酸酯酶，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述阿魏酸酯酶基因可用于体外生成阿魏酸。经检测，去淀粉麦麸混悬液中阿魏酸的释放率为75.3％，远高于其它阿魏酸酯酶基因，为阿魏酸生产提供了新的酶源。
本发明公开了一种阿魏酸酯酶及其突变体与应用。所述的阿魏酸酯酶具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，其性质稳定，反应pH为6‑8，反应温度为37‑54℃。本发明在所述的阿魏酸酯酶的氨基酸序列的基础上分别通过增加阿魏酸酯酶中二硫键的数量、改变其碳水化合物结合模块的侧链基团以及改变催化结构域电荷，得到了三个阿魏酸酯酶突变体N.1‑300、N.7‑16、N.9‑98，与原始阿魏酸酯酶相比，这三个突变体的比酶活均得到明显提高。本发明得到的阿魏酸酯酶以及突变体性质稳定，有助于阿魏酸酯酶的工业化应用。
本发明公开了一种提高阿魏酸酯酶酶活的方法，属于酶工程技术领域。本发明提供了一种序列如SEQ ID NO.2所示的阿魏酸酯酶基因及高效表达阿魏酸酯酶的工程菌，本发明构建的基因工程菌，具有高效的表达能力，分泌表达的阿魏酸酯酶的酶活最高可达39.9U/mL，为今后工业化生产高活性的阿魏酸酯酶提供了思路和方法
本发明公开了一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用，属于生物技术领域。所述耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，包括：步骤1：以卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；步骤2：将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，制备得到阿魏酸酯酶。本发明制备的阿魏酸酯酶的最适反应条件为65℃和pH 7.0，具有良好的耐热性和耐碱性特点，使其在造纸、食品、制药与饲料等领域中具有应用潜力。
本发明提供了一种阿魏酸酯酶基因，其来源于中国牦牛瘤胃微生物，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，编码如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明还提供了含有该基因的马克斯克鲁维酵母重组表达载体及基因工程菌株，并提供了制备阿魏酸酯酶的方法和制得的阿魏酸酯酶的用途。将阿魏酸酯酶在马克斯克鲁维酵母表达系统中重组表达，经高密度发酵48小时后胞内和胞外的阿魏酸酯酶的活力分别为686.35U/mL和346.34U/mL。马克斯克鲁维酵母重组表达的阿魏酸酯酶可释放玉米麸皮中的阿魏酸。利用本发明获得的阿魏酸酯酶，可用于食品加工、饲料添加、生物医药、纤维素物质生物转化、生物能源等领域。
