本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用,属于基因工程及分子免疫学技术领域。本发明的技术方案要点为:一种草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗,该亚单位疫苗蛋白的基因序列如序列表SEQ ID No.1所示。本发明还具体公开了该草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗的制备方法及其作为抗草鱼呼肠孤病毒感染疫苗用于提高草鱼感染草鱼呼肠孤病毒后鱼体的存活率。本发明中草鱼呼肠孤病毒VP35蛋白亚单位疫苗为新型抗原蛋白疫苗,其制备方法简单,成分明确,安全稳定,能够诱导草鱼鱼体产生较高的非特异性和特异性免疫应答,进而获得较好的免疫保护效果。