本发明用于提高硃砂烟尼古丁含量和/或构建高尼古丁含量的硃砂烟突变体的引物及其方法与应用，属于遗传工程技术领域。所述用于提高硃砂烟尼古丁含量和/或构建高尼古丁含量的硃砂烟突变体的引物的上下游序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。基于所述引物，本发明还提供用于提高硃砂烟尼古丁含量和/或构建高尼古丁含量的硃砂烟突变体的基因编辑载体、转化体、试剂盒及方法，以及该方法的应用。本发明采用所述引物对硃砂烟植株进行基因编辑使其发生缺失突变从而达到提高硃砂烟尼古丁含量、构建的高尼古丁含量的硃砂烟突变体的目的。本发明所构建的硃砂烟突变体的叶片尼古丁含量是硃砂烟的5.9倍。
本发明一种创制硃砂烟的引物、重组表达载体、转化体、试剂盒及方法与应用，属于遗传工程技术领域。所述一种创制硃砂烟的引物的上下游引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。基于所述引物，本发明还提供一种创制硃砂烟的重组表达载体、转化体、试剂盒及方法，以及该方法的应用。本发明通过在烟草植株内过表达所述引物扩增的产物可使普通烟草转换成硃砂烟，即，转基因烟草植株的烟叶烤后呈现红色外观，感官评价具有明显的糯米香，转基因烟草植株具有硃砂烟的表型。本发明成功解决了人工创制硃砂烟的难题，填补了人工创制硃砂烟的空白。
本发明公开了一种铁、锰、镁共施提高硃砂烟比例的施肥方法，具体包括以下步骤：A、基肥施用：在硃砂烟移栽前17‑20天，将烟草专用复合肥和腐熟农家肥混施，并结合起垄扣入垄底，其中，烟草专用复合肥施用量为360‑480kg/ha、农家肥施用量为12000‑18000kg/ha；B、追肥施用：包括普通化肥追施和中微量元素肥料追施，在硃砂烟移栽后的15~60d分3次追施烟草专用复合肥540~720kg/hm2和30~35 kg 51%的硫酸钾；在硃砂烟移栽后的60~70d，每株烟追施30‑36mg铁肥、18‑24g镁肥和40‑60mg锰肥。本发明方法能够有效地针对硃砂烟对铁、锰、镁肥的敏感性，促进硃砂烟烟叶中尼古丁的转化，提高硃砂烟比例，弥补硃砂烟田间施肥管理空白。
本发明涉及一种基于NtPIF1基因表达水平筛选硃砂烟植株的方法，所述的基因为NtPIF1基因；序列为SEQ ID NO.1；所述的方法包括以下步骤：单株挂牌编号、叶片取样、RNA提取及cDNA合成、基因表达水平检测本发明首次公开利用NtPIF1基因表达水平筛选硃砂烟植株，且烟草叶片不需进行任何处理直接取样检测，筛选出的植株烤后叶片呈现显著硃砂特征。
