本发明提供了一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域；所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体的构建方法，包括以下步骤：1)将3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶基因与表达载体连接获得野生型重组载体；2)以获得的野生型重组载体为模板，通过反向PCR定点突变获得3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体重组载体；3)将获得的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体重组载体转化到表达菌株获得重组菌株，培养所述重组菌株获得3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体。所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体比酶活为85217.08U/mg，较野生型提高了227.35％。
本发明公开了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶相比，第72位氨基酸由赖氨酸突变为了丙氨酸，本发明首次对亮氨酸脱氢酶底物通道内碱性氨基酸残基进行定点突变，改造了酶可能底物结合位点附近的结构及环境，获得了更加高效制备L‑2‑氨基丁酸的亮氨酸脱氢酶。本发明提供的底物耐受性提高的亮氨酸脱氢酶突变体亮氨酸脱氢酶突变体K72A能耐受4.5g/L 2‑酮丁酸且对于底物2‑酮丁酸的催化活力提高了15％。
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶及其多克隆抗体。双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的制备方法，包括步骤：1)以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶为抗原，免疫小鼠制备抗血清；2)纯化抗血清得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体。本发明利用PCR技术在喜冷杆菌属Cryobacterium中扩增得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶基因，并通过基因工程技术得到Ecoli BL21‑pET21a‑BMTHC重组菌株，诱导表达重组菌株得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白，该蛋白具有较好的低温耐受，而且以双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶为抗原成功得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体。
