[发明专利]一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法及其应用在审
| 申请号： | 201910662025.0 | 申请日： | 2019-07-22 |
| 公开（公告）号： | CN110295147A | 公开（公告）日： | 2019-10-01 |
| 发明（设计）人： | 李秀敏;张黎琛;周孝峰;侯静晗;王素杰;张爱佳;庞丹;卢奎;吕本洁;闫子怡;高灿 | 申请（专利权）人： | 新乡医学院 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/90;C12Q1/6886 |
| 代理公司： | 北京金智普华知识产权代理有限公司 11401 | 代理人： | 杨采良 |
| 地址： | 453003 *** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | 本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法及其应用。本发明通过分别转染目的基因sgRNA与CRISPR/Cas9载体同源重组后的质粒和CRISPR/Cas9的空载，然后利用流式细胞仪分选细胞，接种至六孔板中。余下的细胞裂解获取DNA，PCR后作琼脂糖凝胶鉴定验证。分选的细胞在细胞培养箱中培养2周后，终止培养，以4％多聚甲醛固定后，再经结晶紫染色。此时可肉眼判断每组细胞的克隆形成数目，克隆形成率可准确反映细胞的增殖能力和群体依赖性。根据克隆形成结果即可快速判断食管癌功能基因敲除后的增殖表型，本发明具有高效率、高精确和高通量等优势。 | ||
| 搜索关键词： | 功能基因 表型 敲除 细胞 增殖 食管癌细胞系 快速鉴定 克隆 分选 分子生物学技术 多聚甲醛固定 食管癌 结晶紫染色 流式细胞仪 琼脂糖凝胶 细胞培养箱 快速判断 目的基因 肉眼判断 同源重组 细胞裂解 增殖能力 高通量 高效率 六孔板 空载 质粒 转染 接种 应用 验证 群体 | ||
【主权项】：
1.一种食管癌细胞系中功能基因敲除后增殖表型的快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将食管癌细胞功能基因PARK2基因敲除；步骤2：细胞分选，将功能基因敲除的细胞与空载对照组细胞分别接种至孔板培养；步骤3：将孔板培养的细胞固定后，经结晶紫染色，目测两组细胞的克隆形成率，判断食管癌功能基因敲除后的增殖表型。
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- 本发明涉及一种异种器官移植基础供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在胎儿成纤维细胞的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因，并定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，结合体细胞核移植技术构建GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46多基因修饰的异种移植供体基础猪。本发明在一定程度上解决了异种器官移植中存在的抗原抗体免疫排斥反应及补体调节的共性问题，为在基础供体猪的基础上研究开发适合心脏、肾脏、肝脏等器官及胰岛、皮肤等组织特异性的异种器官移植供体猪的构建奠定了基础，对构建多基因修饰的异种移植供体猪具有重要的应用价值和应用前景。
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- 本发明涉及一种适合心脏异种移植供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在猪胎儿成纤维细胞的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个基因后并定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，再结合体细胞核移植技术构建GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰的异种移植供体基础猪，再在此基础猪的Rosa26位点再定点插入hCD39、hTBM两个心脏功能修饰特异基因，构建出多基因修饰的心脏异种器官移植供体猪再进行功能验证，获得适合心脏异种移植的供体猪。本发明为异种心脏移植提供了可靠的供体猪，为处于终末期的心脏病患者的治疗提供了希望。
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- 郭军;江灿 - 暨南大学
- 2017-04-24 - 2019-10-18 - C12N5/10
- 本发明公开一种钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B诱导iPSCs定向心肌分化的方法，属于医药技术领域。该方法是通过构建NCX1慢病毒颗粒并转染至iPSCs，辅以丹参酚酸B联合诱导。所述的丹参酚酸B的浓度为1～100μM。本发明证实钠钙交换体1启动子联合丹参酚酸B可有效诱导iPSCs心肌定向分化。丹参酚酸B可有效促进NCX1表达，同时促进心肌标志物α肌动蛋白(α‑actin)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达显著提高。且iPSCs形态可见心肌细胞样梭形改变。iPSCs作为修复急性心肌梗死的种子细胞，具有广阔的应用前景。
- 作为HSP27突变型(S135F)携带者的CMT病的动物模型-201480031672.7
- 金润泰;崔炳玉;郑圣哲;洪永彬;禹昭妍;朴晋模 - 三星生命公益财团;株式会社钟根堂
- 2014-04-01 - 2019-10-18 - C12N5/10
- 本发明涉及作为HSP27突变型(S135F)携带者的Charcot‑Marie‑Tooth病(CMT)的动物模型，具体而言，本发明涉及用于对CMT治疗剂候选物的效力进行评价的Charcot‑Marie‑Tooth病(CMT)动物模型，该动物模型通过如下方式获得：将表达突变型HSP27蛋白(其中，第135位的丝氨酸被置换为苯丙氨酸)的表达载体注射进小鼠的胚胎，并选择具有所述表达载体的小鼠，以检查所述小鼠是否展现出CMT的表型。
- 专利分类
