[发明专利]一种快速构建3型鸭甲肝病毒反向遗传株的方法在审
| 申请号： | 201910551110.X | 申请日： | 2019-06-24 |
| 公开（公告）号： | CN110295148A | 公开（公告）日： | 2019-10-01 |
| 发明（设计）人： | 程安春;文兴建;汪铭书 | 申请（专利权）人： | 四川农业大学 |
| 主分类号： | C12N7/01 | 分类号： | C12N7/01;C12N15/41 |
| 代理公司： | 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246 | 代理人： | 张鹏 |
| 地址： | 611130 四*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种快速构建3型鸭甲肝病毒反向遗传株的方法。将3型鸭甲肝病毒全基因组分为大小相近的三个片段进行PCR扩增，第一个片段的5'端添加巨细胞病毒早期启动子，在第二个片段的2A基因中引入同义突变作为遗传标记位点，在病毒基因组第三个片段的3'端添加丁型肝炎病毒核酶序列和猴空泡病毒早期mRNA多腺苷酸化信号序列，完成3型鸭甲肝病毒感染性亚基因组复制子的构建，与转染试剂混合后转染原代鸭胚成纤维细胞，复制子自发重组，最终获得含有遗传标记的3型鸭甲肝病毒。利用该方法可快速获得3型鸭甲肝病毒突变株，这为研究3型鸭甲肝病毒的致病机理、开发新型疫苗等提供了有利的工具。 | ||
| 搜索关键词： | 甲肝病毒 快速构建 复制子 多腺苷酸化信号 鸭胚成纤维细胞 丁型肝炎病毒 遗传标记位点 遗传 病毒基因组 猴空泡病毒 巨细胞病毒 早期启动子 核酶序列 全基因组 同义突变 新型疫苗 亚基因组 遗传标记 致病机理 转染试剂 感染性 突变株 构建 转染 引入 开发 研究 | ||
【主权项】：
1.一种快速构建3型鸭甲肝病毒反向遗传株的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将亲本病毒株全基因组分为大小相近的三个片段进行PCR扩增，在病毒基因组第一个片段的5'端添加巨细胞病毒早期启动子，在第二个片段的2A基因中引入同义突变作为遗传标记位点，在第三个片段的3'端添加丁型肝炎病毒核酶序列和猴空泡病毒早期mRNA多腺苷酸化信号序列，获得三个DNA片段，构成3型鸭甲型肝炎病毒感染性亚基因组复制子；2)将构建的感染性亚基因组复制子与转染试剂混合后转染鸭胚成纤维细胞，复制子在宿主细胞内转录并利用细胞的同源重组机制自发重组，形成具有感染性的完整病毒转录本，继而导致病毒的复制与增殖，获得含有遗传标记的3型鸭甲型肝炎病毒反向遗传株病毒。
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- 本发明提供了一种靶向wnt信号通路溶瘤腺病毒的构建方法，包括将启动子插入pXC2‑Δ24中并连接到质粒中，酶切；将TSLC1基因与质粒连接，将连接产物与DH5α感受态细胞混合，酶切；将上述两个步骤得到的终产物连接，转化到含有全序列腺病毒骨架的质粒大肠杆菌中重组，产生E1A区由启动子控制代替E1A内源启动子的以及缺失E1A‑CR2区的24碱基的腺病毒骨架DNA质粒；腺病毒骨架DNA质粒用pacⅠ酶切线性转化后，转染到293A细胞中病毒包装，病变后，得到溶瘤腺病毒Ad.wnt‑E1A(Δ24)‑TSLC1。采用本发明的构建方法得到的溶瘤腺病毒对结肠癌细胞和肝癌细胞具有明显的杀伤效果。
- 重组腺病毒、和四价腺病毒疫苗及其制备方法-201610898984.9
- 田新贵;周荣;蒋再学;马强;李潇;周志超 - 广州呼研所医药科技有限公司;广州呼吸疾病研究所
- 2016-10-14 - 2019-08-09 - C12N7/01
- 本发明公开了一种重组腺病毒、和四价腺病毒疫苗及其制备方法，所述四价重组腺病毒疫苗，包括重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株。本发明首先通过制备包含不同六邻体基因片段在内的重组穿梭质粒，与重组人3型腺病毒基因组进行细菌内同源重组，获得六邻体基因片段被替换为7型、14型、55型的重组腺病毒基因组，转染细胞后拯救得到主要衣壳蛋白‑六邻体蛋白不同的重组人3型、7型、14型、55型重组腺病毒。纯化后按相同蛋白质含量混合，再用β‑内丙脂进行灭活，得到四价腺病毒疫苗，该四价腺病毒疫苗可以诱导出对四种血清型腺病毒的中和抗体应答，中和效价均为500‑1000。
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